[發(fā)明專利]單壁碳納米角?鉑鈀納米粒和巨細(xì)胞病毒pp65抗體修飾電極及其制備方法和應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2014-08-20
• 公開（公告）號: CN104132984B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃微微;蒲曉允;張立群;蔣棟能;劉飛
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院
• 主分類號: G01N27/327
• 分類號: G01N27/327;G01N27/48
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于診斷領(lǐng)域，具體涉及單壁碳納米角-鉑鈀納米粒和巨細(xì)胞病毒pp65抗體修飾電極，還涉及該電極的制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

巨細(xì)胞病毒(Cytomegaovirus，CMV)是皰疹病毒家族，具有嚴(yán)格的種屬特異性。在發(fā)達(dá)國家成人CMV的隱形感染率40％～90％，我國CMV的隱形感染率高達(dá)90％左右。CMV是導(dǎo)致胎兒先天性感染的最常見的病原體。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，約0.5％～2.5％新生兒中感染過CMV。感染CMV的孕婦可通過胎盤、產(chǎn)道、哺乳方式垂直傳播給胎兒或新生兒，也可通過親密接觸進(jìn)行水平傳播，最終導(dǎo)致胎兒畸形、新生兒智力低下或發(fā)育遲緩；CMV亦可通過輸血和器官移植傳播，是免疫功能低下的艾滋病患者、腫瘤患者死亡的主要原因，是導(dǎo)致器官移植失敗的重要原因之一。多項(xiàng)研究表明，CMV感染還與動脈粥樣硬化等多種疾病有關(guān)，所以CMV的檢測顯得尤為重要。CMV?pp65抗原是CMV活動性感染的早期標(biāo)志物，主要存在于人類肝細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，膽管內(nèi)皮細(xì)胞，外周血白細(xì)胞中，可作為檢測CMV活動性感染的指標(biāo)。

現(xiàn)有的檢測方法主要包括細(xì)胞培養(yǎng)、病毒學(xué)檢測、免疫檢測，核酸檢測等，其中細(xì)胞培養(yǎng)是診斷CMV感染的金標(biāo)準(zhǔn)，但是這些方法均存在著操作繁瑣，檢測效率低，特異性差等缺點(diǎn)。例如，細(xì)胞培養(yǎng)耗費(fèi)大，對技術(shù)人員要求高，臨床應(yīng)用受限；病毒學(xué)檢查需從受檢者的血、尿、唾液或組織等中分離并培養(yǎng)出CMV，操作過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力；血清學(xué)CMV?IgG、IgM抗體檢測特異性差，對新生兒或嚴(yán)重免疫缺陷者可能存在假陰性，并且會受類風(fēng)濕因子等干擾；分子生物學(xué)核酸檢測則需專業(yè)人員和特殊儀器來完成，費(fèi)用高，并且無法區(qū)分潛伏性感染。因此，人們急需一種靈敏度高，特異性好，快速和準(zhǔn)確的檢測CMV的電化學(xué)免疫傳感器，這對優(yōu)生優(yōu)育，監(jiān)控疾病進(jìn)展及成功移植器官具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供單壁碳納米角-鉑鈀納米粒(Pt-PdNPsSWCNHs)和CMV?pp65抗體修飾電極；本發(fā)明的目的之二在于提供上述Pt-PdNPsSWCNHs和CMV?pp65抗體修飾電極的制備方法；本發(fā)明的目的之三在于提供含有Pt-PdNPsSWCNHs和CMV?pp65抗體修飾電極的電化學(xué)傳感器，本發(fā)明的目的之四在于提供利用上述電化學(xué)生物傳感器檢測CMV?pp65抗原的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1.Pt-PdNPsSWCNHs和CMVpp65抗體修飾電極，所述電極是由全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜(Nafion，Nf)分散的SWCNHs處理后吸附硫堇(Thionine，Thi)，然后結(jié)合Pt-PdNPsSWCNHs，再用CMV?pp65抗體孵育、HRP封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)即可。

優(yōu)選的，所述全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物膜分散的單壁碳納米角(SWCNHs-Nf)由以下方法制備：將SWCNHs加入Nf中，超聲攪拌過夜制得。

更優(yōu)選的，所述Pt-PdNPsSWCNHs由以下方法制備：向殼聚糖(Chitosan，CS)溶液中加入SWCNHs，超聲分散后離心，沉淀物用雙蒸水洗滌后分散于雙蒸水中，再向其中加入H₂PtCl₆和K₂PdCl₄，攪拌，然后滴加硼氫化鈉(NaBH₄)，超聲、離心、洗滌沉淀，將沉淀用雙蒸水分散即可。

2.所述Pt-PdNPsSWCNHs和CMV?pp65抗體修飾電極的制備方法，包括如下步驟：

a.將玻碳電極表面打磨，拋光，干燥，得預(yù)處理的電極；

b.將步驟a所得預(yù)處理的電極用SWCNHs-Nf修飾，23～26℃干燥，得SWCNHs-Nf修飾的電極；所述SWCNHs-Nf由將SWCNHs加入Nf中，超聲攪拌過夜制得；

c.將b步驟所得SWCNHs-Nf修飾的電極上吸附Thi，然后雙蒸水清洗；

d.將步驟c所得電極上吸附Pt-PdNPsSWCNHs，然后用雙蒸水清洗，得Pt-PdNPsSWCNHs修飾的電極；所述Pt-PdNPsSWCNHs由如下方法制備：向CS溶液中加入SWCNHs，超聲分散后離心，沉淀物用雙蒸水洗滌后分散于雙蒸水中，再向其中加入H₂PtCl₆和K₂PdCl₄，攪拌，然后滴加NaBH₄，超聲、離心、洗滌沉淀，將沉淀用雙蒸水分散即可；