[發明專利]梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒及其制備方法

有效

• 申請號: 201410410477.7
• 申請日: 2014-08-20
• 公開（公告）號: CN104155450A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 張惠林;林麗蓉;童曼莉;劉莉莉;楊天賜;張長弓
• 申請（專利權）人: 廈門大學附屬中山醫院
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531
• 代理公司: 廈門南強之路專利事務所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應森

1.梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于設有外包裝盒、濃縮洗滌液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、反應終止液瓶、包被有重組抗原微孔板；

濃縮洗滌液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶、生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、反應終止液瓶和包被有重組抗原微孔板裝在外包裝盒內；

濃縮洗滌液瓶內裝有濃縮洗滌液，陰性對照品瓶內裝有陰性對照品，陽性對照品瓶內裝有陽性對照品，生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶內裝有生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體，辣根過氧化物酶標記親和素瓶內裝有辣根過氧化物酶標記親和素，TMB顯色液A瓶內裝有TMB顯色液A，顯色液B瓶內裝有顯色液B，反應終止液瓶內裝有反應終止液；

所述TMB顯色液A為3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine，TMB)顯色液；

所述顯色液B為3％的過氧化氫溶液。

2.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述濃縮洗滌液可采用溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0.05％。

3.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述陰性對照品為梅毒螺旋體總抗體陰性對照品，由非梅毒感染的健康人群血清配制而成。

4.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述陽性對照品為梅毒螺旋體總抗體陽性對照品，由梅毒患者的陽性血清配制而成。

5.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒，其特征在于所述反應終止液為摩爾濃度2mmol/L的硫酸。

6.如權利要求1所述梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)提取梅毒螺旋體Nichol株和Reiter株外膜蛋白進行雙向電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，用梅毒血清進行免疫印跡實驗，獲得特征性的免疫印跡斑點，取對應的蛋白點進行質譜分析，分別找出Nichol株和Reiter株具有較高免疫原性的外膜蛋白，并找出Nichol株特有而Reiter株缺少的高免疫原性的外膜蛋白；

2)在梅毒螺旋體的全基因組序列中找出對應基因，設計引物并構建相應的表達載體。研究不同誘導條件對重組目標蛋白在大腸桿菌中表達量的影響，獲得最佳誘導條件，大量擴增目標蛋白，收集過表達的目標蛋白進行純化，純度高于90％后，進行后續研究；

3)將步驟2)候選抗原，通過免疫大鼠獲得其相應多克隆抗體，采用酶聯免疫方法測定抗體滴度，并使用免疫印跡方法驗證這些重組抗原的免疫原性；

4)采用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，并插入大腸桿菌中使其表達，得梅毒螺旋重組抗原；

5)將步驟(4)中的梅毒螺旋重組抗原用包被緩沖液稀釋至20ug/mL，以每孔0.1mL加入微孔板中，4℃包被24h；取出抗原板，風干；用0.01mmol/L?pH7.4磷酸鹽緩沖液配制的1.0％脫脂奶粉，每孔0.2mL，4℃封閉24h，取出用磷酸鹽緩沖液洗滌5次，室溫風干、消毒、密封備用，得重組抗原包被微孔板；

6)以人IgG特異性片段γ鏈為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定分泌抗人IgG單克隆抗體的雜交瘤細胞株；

7)將抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體與活化的生物素混合進行標記，透析去除未結合的生物素，制備生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體；

8)采用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記，得辣根過氧化物酶標記親和素；

9)TMB顯色液A采用市售品，可購自廈門波生生物科技有限公司；

10)顯色液B采用市售品，可購自廈門波生生物科技有限公司；

11)配制溶有Tween-20的磷酸鹽緩沖液，其中Tween-20的終濃度為0.05％，得濃縮洗滌液，使用時可用蒸餾水進行20倍稀釋；

12)配制2mmol/L的硫酸作為反應終止液；

13)由非梅毒感染的健康人群血清配制梅毒螺旋體IgG抗體陰性對照品，使用本試劑盒進行檢測其OD450nm吸光值小于0.1；所述OD450nm為主波長，450nm是測定的樣本顯色吸光值；

14)由梅毒患者的陽性血清配制梅毒螺旋體IgG抗體陽性對照品，使用本試劑盒進行檢測其OD450nm吸光值大于0.5；所述OD450nm為主波長，450nm是測定的樣本顯色吸光值；

15)將生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記親和素、TMB顯色液A、顯色液B、濃縮洗滌液、反應終止液、陰性對照品、陽性對照品分別裝在瓶中，再將生物素標記抗人IgG特異性片段γ鏈單克隆抗體瓶、辣根過氧化物酶標記親和素瓶、TMB顯色液A瓶、顯色液B瓶、濃縮洗滌液瓶、反應終止液瓶、陰性對照品瓶、陽性對照品瓶以及包被有重組抗原微孔板裝入外包裝盒中，得到梅毒螺旋體IgG抗體生物素親和素酶聯免疫檢測試劑盒。