[發(fā)明專利]表達(dá)和純化RANK胞外區(qū)域蛋白的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410410449.5
• 申請(qǐng)日: 2009-03-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104152481B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐佩福;劉長(zhǎng)振;黃鵬;張世謙;高斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院;北京表源生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C07K14/705;C07K1/14
• 代理公司: 北京康信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司11240
• 代理人: 吳貴明,張永明

本申請(qǐng)是基于申請(qǐng)日為2009年3月26日、申請(qǐng)?zhí)枮?00910080733.X、發(fā)明創(chuàng)造名稱為“鼠RANK/RANKL胞外復(fù)合體的晶體，制備其的方法及其應(yīng)用”專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及純化和表達(dá)RANK胞外蛋白的方法，還提供了一種RANK/RANKL復(fù)合體的晶體，尤其提供了一種鼠RANK/RANKL胞外蛋白形成的晶體。本發(fā)明提供了一種制備鼠RANK/RANKL胞外復(fù)合體晶體的方法，以及該復(fù)合體結(jié)構(gòu)在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

腫瘤壞死因子(TNF)家族中的細(xì)胞因子在諸如炎癥反應(yīng)、器官發(fā)生、宿主防御、自身免疫和細(xì)胞凋亡等多種生物功能中扮演著重要的角色。這些生物調(diào)節(jié)因子是通過(guò)受體-配體相互作用，從而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞以及細(xì)胞表型的改變而發(fā)揮相應(yīng)的生理作用的。作為T(mén)NF家族成員的RANKL以及其受體RANK在生物體內(nèi)的多種活動(dòng)中扮演著重要的角色，其對(duì)于骨的重塑過(guò)程起到了重要的調(diào)節(jié)作用，并且RANK以及RANKL分子之間的相互作用還可調(diào)節(jié)T細(xì)胞/樹(shù)突狀細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、樹(shù)突狀細(xì)胞的存活以及淋巴組織的發(fā)育，近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。

在人體骨的重塑過(guò)程中，破骨細(xì)胞是骨重塑的“啟動(dòng)子”，成骨細(xì)胞是骨重塑的“調(diào)節(jié)者”，骨吸收類疾病共同的病理特征為破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)異常導(dǎo)致骨形成和骨吸收之間喪失平衡，因此深入了解破骨細(xì)胞的激活機(jī)制將對(duì)于成功防治骨吸收類疾病的發(fā)生有著至關(guān)重要的意義。1997年，幾個(gè)不同的研究小組發(fā)現(xiàn)了腫瘤壞死因子受體-配體超家族新成員：骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin,OPG)、RANKL以及RANK；隨后，多項(xiàng)研究相繼顯示：RANKL、OPG具有調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、發(fā)育、影響其功能的作用，RANK是RANKL、OPG發(fā)揮作用的關(guān)鍵，它們形成一個(gè)骨調(diào)節(jié)軸，來(lái)調(diào)節(jié)骨的重塑過(guò)程。

RANKL為一種II型跨膜蛋白，其多為三個(gè)單體聚合成的復(fù)合體，主要分布在活化T細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞等細(xì)胞中，目前認(rèn)為哺乳動(dòng)物中存在三種RANKL蛋白：RANKL1、RANKL2、RANKL3，其中前兩種為膜結(jié)合蛋白，后一種為被分泌到胞外的可溶性蛋白。人和大鼠的RANKL分子分別包含317、316個(gè)氨基酸殘基，具有87％的同源性；人類RANKL基因位于13q14，其啟動(dòng)子區(qū)包含成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子cbaf-1的活性。RANKL mRNA可在多種組織表達(dá)，以骨骼和淋巴組織中最高，在骨骼中，RANKL主要表達(dá)于骨小梁和骨髓；在骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞均可檢測(cè)到RANKL mRNA。2004年Ito S等人以及國(guó)際專利申請(qǐng)NO.WO 03/014077都披露了RANKL的三維結(jié)構(gòu)，其全部?jī)?nèi)容結(jié)合于此作為參考。各項(xiàng)研究表明：每一個(gè)RANKL單體包括一個(gè)夾層結(jié)構(gòu)，其由兩個(gè)平面反平行β-折疊片層構(gòu)成。第一個(gè)片層由β-鏈A”、A、H、C及F組成，第二個(gè)片層由B’、B、G、D及E組成，其中第一片層為內(nèi)層β-片層，該片層富含疏水性氨基酸，并通過(guò)疏水作用與另外兩個(gè)RANKL相互結(jié)合，而B(niǎo)’、B、G、D及E鏈形成外層β-片層，該片層多為帶電及極性氨基酸，負(fù)責(zé)與受體RANK結(jié)合；每一個(gè)RANKL單體中的β-夾層結(jié)構(gòu)的一個(gè)邊緣、鏈E及F包裹相鄰單體的AHCFβ-片層的內(nèi)部疏水層從而形成RANKL三聚體結(jié)構(gòu)。RANKL三聚體的晶體結(jié)構(gòu)特征是：具有P2₁2₁2₁的空間群，晶胞參數(shù)為以及空間群R3，胞晶為其形狀就像被截平了的錐形，靠近膜的一端寬于遠(yuǎn)端的頂點(diǎn)處。RANKL三聚體高底部直徑約為頂點(diǎn)處的直徑約為

RANK是RANKL的受體，屬于TNF受體家族，是一種I型跨膜蛋白，人RANK分子在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞和成熟破骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量較高。RANK基因定位于18q22.1，其編碼的蛋白質(zhì)在體內(nèi)以跨膜蛋白型存在，其表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞系、破骨細(xì)胞前體細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等，表達(dá)于破骨細(xì)胞前體細(xì)胞膜表面的RANK介導(dǎo)RANKL的信號(hào)，發(fā)揮調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的功能。