[發明專利]表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法

有效

• 申請號: 201410410449.5
• 申請日: 2009-03-26
• 公開（公告）號: CN104152481B
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 唐佩福;劉長振;黃鵬;張世謙;高斌
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍總醫院;北京表源生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/705;C07K1/14
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司11240
• 代理人: 吳貴明,張永明

1.一種表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法，包括：

(1)構建具有編碼RANK胞外區域的cDNA的載體，將所述載體轉化到原核細胞中，從而得到以包涵體形式表達的重組RANK；所述RANK的胞外區域是指鼠RANK單體N-末端從26位氨基酸至210位氨基酸的區域；所述鼠RANK單體的氨基酸序列為：

MAPRARRRRQLPAPLLALCVLLVPLQVTLQVTPPCTQERHYEHLGRCCSRCEPGKYLSSKCTPTSDSVCLPCGPDEYLDTWNEEDKCLLHKVCDAGKALVAVDPGNHTAPRRCACTAGYHWNSDCECCRRNTECAPGFGAQHPLQLNKDTVCTPCLLGFFSDVFSSTDKCKPWTNCTLLGKLEAHQGTTESDVVCSSSMTLRRPPKEAQAYLPSLIVLLLFISVVVVAAIIFGVYYRKGGKALTANLWNWVNDACSSLSGNKESSGDRCAGSHSATSSQQEVCEGILLMTREEKMVPEDGAGVCGPVCAAGGPWAEVRDSRTFTLVSEVETQGDLSRKIPTEDEYTDRPSQPSTGSLLLIQQGSKSIPPFQEPLEVGENDSLSQCFTGTESTVDSEGCDFTEPPSRTDSMPVSPEKHLTKEIEGDSCLPWVVSSNSTDGYTGSGNTPGEDHEPFPGSLKCGPLPQCAYSMGFPSEAAASMAEAGVRPQDRADERGASGSGSSPSDQPPASGNVTGNSNSTFISSGQVMNFKGDIIVVYVSQTSQEGPGSAEPESEPVGRPVQEETLAHRDSFAGTAPRFPDVCATGAGLQEQGAPRQKDGTSRPVQEQGGAQTSLHTQGSGQCAE；

(2)對所述包涵體進行超聲處理，然后重新溶解在6M的鹽酸胍中，得到解離狀態的所述重組RANK；

(3)重新折疊所述重組RANK，所述重新折疊的過程包括：

將所述包涵體稀釋在包含20mM、pH值為7.3的Na₂HPO₄、1M L-精氨酸、20％甘油、10mM還原型谷胱苷肽以及1mM氧化型谷胱苷肽的復性(IB)溶液中，得到第一復性液；

將所述第一復性液稀釋在含有20mM、pH值為7.3的Na₂HPO₄、0.5M L-精氨酸、10％甘油的重新折疊緩沖液1中4℃下透析12小時，得到第二復性液；

將所述第二復性液稀釋在含有20mM、pH值為7.3的Na₂HPO₄、0.2M L-精氨酸、5％甘油的重新折疊緩沖液2中4℃下透析12小時，得到第三復性液；

將所述第三復性液稀釋在20mM、pH值為7.3的Na₂HPO₄、0.2M L-精氨酸中4℃下透析12小時，得到第四復性液；將所述第四復性液離心，得上清液；

(4)將所述上清液利用瓊脂75柱進行分離；

(5)通過SDS-PAGE收集并分析正確折疊的RANK。

2.根據權利要求1所述的表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法，其中所述cDNA為鼠RAW264.7細胞的mRNA經逆轉錄PCR技術所獲得的產物。

3.根據權利要求1所述的表達和純化RANK胞外區域蛋白的方法，其中所述原核細胞為E.coli菌株BL21-Gold。