[發明專利]一種建立鵝胚上皮細胞系的方法及建立的鵝胚上皮細胞系

有效

• 申請號: 201410408788.X
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104152403B
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 王文秀;沈志強;于金枝
• 申請（專利權）人: 山東省濱州畜牧獸醫研究院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N7/00;C12R1/91
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

1.一種鵝胚上皮細胞系，其特征在于：保藏號為CCTCC NO：C2014137，其制備包括如下步驟：

(1)原代細胞貼壁培養：無菌收集鵝胚組織，加入濃度為PBS 10mL，清洗5～10分鐘，棄去PBS后，加入10～20mL含有抗生素的消毒液處理5～10分鐘，取出鵝胚組織并剪成0.5～1.5mm³ 的組織塊，將組織塊平貼入培養板的孔底，每孔一塊，向培養孔加入2～3mL培養液I，置于37℃、5％CO₂ 條件下培養至組織塊完全貼壁，然后加入培養液I至2～3mL，在37℃、5％CO₂ 條件下培養，培養期間更換培養液；

(2)傳代培養：貼壁培養的細胞長成單層細胞后，棄去培養液I，用胰酶消化處理，大部分成纖維樣細胞脫落，棄去脫落的細胞，在6孔板加入細胞培養液II2-3mL，置于37℃、5％CO2條件下培養；

(3)鵝上皮細胞系的單克隆篩選：以傳代培養法連續傳代至第5代后，將細胞用胰酶消化處理至單個細胞，然后按照平均1.5個細胞/孔的密度接種到培養板，標記接種單個細胞的孔，待所述單個細胞的孔中的細胞長成上皮樣細胞克隆團即得到鵝上皮細胞系的單克隆；

所述培養液I為含有體積比10％胎牛血清，1％-2％的鵝血清及0.2％-1％鵝胚尿囊液的DMEM；

所述培養液II為含有體積比5％新生牛血清的DMEM。

2.根據權利要求1所述的鵝胚上皮細胞系，所述胰酶消化處理指用1～5g/L的胰蛋白酶溶液消化30s～60s。

3.根據權利要求1所述的鵝胚上皮細胞系，所述含抗生素的消毒液為用PBS配制的質量百分比濃度為20％～70％的慶大霉素溶液。

4.根據權利要求1～3任一所述的鵝胚上皮細胞系，所述鵝胚組織為來源于孵化10～12日齡的鵝胚胎除腦、眼、四肢、內臟之外的任何組織。

5.用于培養和/或增殖禽病毒的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的鵝胚上皮細胞系，所述鵝胚上皮細胞系用作所述禽病毒的待感染宿主細胞，所述禽病毒指小鵝瘟病毒、番鴨細小病毒、I型鴨肝炎病毒和/或新型鴨肝炎病毒。

6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，還包含用于病毒培養和/或增殖的常規試劑。

7.權利要求1所述的鵝胚上皮細胞系在制備培養和/或增殖禽病毒的試劑盒中的用途，其特征在于，采用所述鵝胚上皮細胞系作為所述禽病毒的待感染宿主細胞，所述禽病毒指小鵝瘟病毒、番鴨細小病毒、I型鴨肝炎病毒和/或新型鴨肝炎病毒。