[發(fā)明專利]一種水樣中鎘離子污染阻斷ELISA檢測(cè)法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410407856.0
• 申請(qǐng)日: 2014-08-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104155424A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李生濤;劉耀東;丁文敏;齊子鑫;王新炎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南華牧生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/18
• 分類號(hào): G01N33/18
• 代理公司: 無(wú)
• 代理人: 無(wú)

1.一種水樣中鎘離子污染阻斷ELISA檢測(cè)法，其特征在于：具體方法如下：

1）取10mL水樣加入30mg?EDTA鈉鹽，充分溶解，NaOH調(diào)節(jié)pH值為6.0，室溫反應(yīng)24小時(shí)；

2）在酶標(biāo)板上加入濃度為1.0μg/mL的Cd²⁺-ITCBE-OVA，每孔50μL，37℃溫育2小時(shí)，PBST洗板3次，每次間隔3分鐘；

3）用5%豬血清封閉酶標(biāo)孔，每孔250μL，37℃溫育1小時(shí)，PBST洗板3次，每次間隔3分鐘；

4）每孔加入50μL工作濃度的Cd²⁺-EDTA單抗，同時(shí)加入等體積的待測(cè)樣品及不同濃度的Cd²⁺標(biāo)準(zhǔn)品與EDTA的鰲合物，設(shè)陰性和空白對(duì)照，37℃溫育15分鐘，PBST洗板3次，每次間隔3分鐘；

5）加入工作濃度的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，每孔50μL，37℃溫育25分鐘，PBST洗板3次，每次間隔3分鐘；

6）加入TMB底物液，每孔100μL，室溫顯色5分鐘；

7）加入終止液，每孔100μL，酶標(biāo)儀讀取A_450nm值；

8）結(jié)果判定：以吸光率B/B₀為縱坐標(biāo)，B是Cd²⁺不同濃度時(shí)Cd²⁺-EDTA的A_450nm值，B0是Cd²⁺0濃度時(shí)Cd²⁺-EDTA的A_450nm值，以不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，根據(jù)各樣品的B/B₀值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水樣中鎘離子污染阻斷ELISA檢測(cè)法，其特征在于：所述的Cd²⁺-ITCBE-OVA檢測(cè)抗原的制備方法如下：將20mg?BSA和OVA分別溶于1mL?pH8.0的HEPES緩沖液(10mM/L)中形成20mg/mL的載體蛋白溶液；?Cd²⁺-ITCBE鰲合物半抗原溶液與載體蛋白溶液按1:1的比例混合并用NaOH調(diào)節(jié)pH值至9.0，室溫?fù)u床反應(yīng)24小時(shí)，然后移入分子量為8000～14000透析袋中透析5天，形成Cd²⁺-ITCBE-OVA檢測(cè)抗原。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種水樣中鎘離子污染阻斷ELISA檢測(cè)法，其特征在于：所述的Cd²⁺-EDTA單克隆抗體的制備方法為：

1）用Cd²⁺-ITCBE-BSA背部、皮下、多點(diǎn)以50μg?/只·0.2?mL的劑量免疫Balb/C小鼠5只，共免5次，每次間隔4周，最后1次免疫后10?d斷尾采血分離血清；

2）用Cd²⁺-ITCBE-OVA為包被抗原包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠抗血清效價(jià)；將乙二胺四乙酸鈉鹽(EDTA)溶液與不同濃度梯度的Cd²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，調(diào)節(jié)pH值為6.0，室溫?fù)u床反應(yīng)24小時(shí)，制成Cd²⁺-EDTA鰲合物溶液做為抑制劑，采用阻斷ELISA試驗(yàn)檢測(cè)免疫小鼠抗血清的敏感性；

選擇抗血清效價(jià)高、并且抗血清對(duì)Cd²⁺-EDTA鰲合物的50%抑制濃度(IC₅₀)低的小鼠用Cd²⁺-ITCBE-BSA進(jìn)行尾靜脈超免；

3）無(wú)菌手術(shù)摘取超免小鼠的脾臟，制成脾細(xì)胞溶液；用分子量為1500的50%的聚乙二醇將脾細(xì)胞與與NS0骨髓瘤細(xì)胞按10:1的比例進(jìn)行細(xì)胞融合，將融合后的細(xì)胞加到含飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔100μL，置37℃?5%?CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4）用Cd²⁺-ITCBE-OVA為包被抗原包被酶標(biāo)板，以Cd²⁺-EDTA鰲合物溶液以及汞、鉻、鉛、鋅、銅、銫、鈷、鉬、鐵與EDTA的鰲合物溶液和EDTA溶液做為抑制劑，采用間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選；選擇效價(jià)高、抑制效果好、特異性強(qiáng)、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔采用有限稀釋法進(jìn)行克隆化；對(duì)單克隆細(xì)胞孔采用間接ELISA和阻斷ELISA進(jìn)行篩選，并對(duì)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

5）給腹腔注射液體石蠟10?d后的小鼠腹腔注射克隆化特異性強(qiáng)的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株10⁷個(gè)細(xì)胞，7?d后抽取腹水，提純后即為抗Cd²⁺-EDTA鰲合物腹水型單克隆抗體。