[發明專利]一種水樣中鎘離子污染阻斷ELISA檢測法

無效

• 申請號: 201410407856.0
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104155424A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 李生濤;劉耀東;丁文敏;齊子鑫;王新炎
• 申請（專利權）人: 河南華牧生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/18
• 分類號: G01N33/18
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于免疫學檢測技術領域，主要涉及水樣中重金屬鎘離子污染的免疫學定量檢測，具體涉及一種水樣中鎘離子污染阻斷ELISA檢測法。

背景技術

隨著工業的發展，重金屬鎘(cadmium,?Cd)已成為環境污染的公害之一。環境中Cd主要以離子形式（Cd²⁺）存在，對人體具有腎臟、骨骼、肺臟、心血管等毒性作用和致癌、致畸、致突變等危害作用。因此，Cd²⁺污染的檢測技術成為國內外學者的研究熱點之一。

目前Cd²⁺污染的檢測主要有傳統的理化檢測和免疫學檢測兩種類型的方法。理化檢測是目前Cd²⁺污染檢測的主要方法，靈敏度高，結果準確，但由于存在需要昂貴的儀器設備、熟練的專業人員、煩瑣費時、周期長、費用高、不能現場操作、樣品篩檢量小等缺陷，其應用受到了限制。Cd²⁺污染免疫檢測是一種新型的分析方法，是以抗原抗體的特異性反應為基礎的分析技術，與理化分析方法相比，具有省時省力、費用低廉、快速、敏感、特異、篩檢量大、便于攜帶、操作簡便等優點，代表著今后重金屬污染檢測的發展趨勢。

本發明通過研制出水樣中Cd²⁺污染快速定量檢測產品，旨在建立方便、快捷、有效的環境水樣Cd²⁺污染監督檢測技術體系，對保障生態環境及公共衛生安全具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的不足而提供一種水樣中鎘離子污染阻斷ELISA檢測法，該方法檢測結果準確性高、重復性好，檢測成本低。

本發明的目的是這樣實現的：

水樣中Cd²⁺污染阻斷ELISA快速定量檢測法的原理是：將水樣中的Cd²⁺與過量EDTA鰲合形成Cd²⁺-EDTA鰲合物；水樣中的Cd²⁺-EDTA鰲合物與已經包被在酶標板上的Cd²⁺-ITCBE-OVA競爭Cd²⁺-EDTA單克隆抗體的抗原結合位點，添加HRP標記的羊抗鼠IgG和底物顯色液，終止顯色后，酶標儀讀取A_450nm值，與標準曲線對照，即可得出水樣中Cd²⁺濃度。

本發明選用異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE）為雙功能鰲合劑鰲合Cd²⁺形成Cd²⁺鰲合物半抗原，并將其耦連到牛血清蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)上形成Cd²⁺-ITCBE-BSA和Cd²⁺-ITCBE-OVA兩種完全抗原，用Cd²⁺-ITCBE-BSA為免疫原免疫Balb/C小鼠，用Cd²⁺-ITCBE-OVA為檢測抗原，通過細胞融合技術，以間接ELISA和阻斷ELISA篩選建立抗Cd²⁺-EDTA的雜交瘤細胞系，體內誘生腹水法制備Cd²⁺-EDTA單抗，以制備的高親和力配對單抗為核心試劑，研制出環境水樣中Cd²⁺污染阻斷ELISA快速定量檢測方法。本發明的標準曲線回歸方程為y＝－31.796x＋89.63，R²＝0.9902，IC₅₀為17.78μg/L，檢測范圍為5.0～512μg/L。

一種水樣中鎘離子污染阻斷ELISA檢測法，具體方法如下：

1）取10mL水樣加入30mg?EDTA鈉鹽，充分溶解，NaOH調節pH值為6.0，室溫反應24小時；

2）在酶標板上加入濃度為1.0μg/mL的Cd²⁺-ITCBE-OVA，每孔50μL，37℃溫育2小時，PBST洗板3次，每次間隔3分鐘；

3）用5%豬血清封閉酶標孔，每孔250μL，37℃溫育1小時，PBST洗板3次，每次間隔3分鐘；

4）每孔加入50μL工作濃度的Cd²⁺-EDTA單抗，同時加入等體積的待測樣品及不同濃度的Cd²⁺標準品與EDTA的鰲合物，設陰性和空白對照，37℃溫育15分鐘，PBST洗板3次，每次間隔3分鐘；

5）加入工作濃度的HRP標記的羊抗鼠IgG，每孔50μL，37℃溫育25分鐘，PBST洗板3次，每次間隔3分鐘；

6）加入TMB底物液，每孔100μL，室溫顯色5分鐘；