[發(fā)明專利]使用PNA探針和等速電泳檢測遺傳序列

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410407430.5
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104419764A
• 公開（公告）日: 2015-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: M·貝爾科維奇;N·奧斯特洛莫胡;O·施瓦茲
• 申請（專利權(quán)）人: 技術(shù)研發(fā)基金有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 趙蓉民;張全信

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明尤其涉及用于序列特異性地分離和/或鑒定核酸分子的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：肽核酸(PNA)分子；和等速電泳(ITP)分離系統(tǒng)。

背景技術(shù)

等速電泳(ITP)是電泳變體，其特征在于分離在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)中進(jìn)行的事實(shí)。待分離的樣品材料插入“前導(dǎo)電解質(zhì)”和“終止電解質(zhì)”之間或在這些中的任一種中混合，這兩種緩沖液的特征是前導(dǎo)者具有的離子凈遷移率必須高于樣品離子的凈遷移率，而終止者具有的離子凈遷移率必須低于樣品離子的凈遷移率。在此類系統(tǒng)中，以由所謂的Kohlrausch調(diào)節(jié)函數(shù)控制的復(fù)雜模式，樣品組分根據(jù)從前導(dǎo)者到終止者漸減的遷移率給自身排序。該過程已得到重復(fù)描述，如例如Bier和Allgyer,Electrokinetic?Separation?Methods443-69(Elsevier/North-Holland1979)。

ITP的進(jìn)一步特征在于最終達(dá)到穩(wěn)態(tài)，這時所有組分均在邊界清楚的毗鄰區(qū)中以相同速度(因此得名)遷移。通過插入其遷移率在希望分離的組分中間的“間隔物”，樣品組分可在此類毗鄰組分串中分離。

等電聚焦(IEF)有時也稱為電聚焦，是電泳的有力變體。IEF的原理基于下述事實(shí)：蛋白質(zhì)和肽以及大多數(shù)生物材料在性質(zhì)上是兩性，即在酸性介質(zhì)中帶正電并且在堿性介質(zhì)中帶負(fù)電。在稱為等電點(diǎn)(PI)的特定pH值下，存在凈電荷極性的逆轉(zhuǎn)，從而生物材料獲得零凈電荷。

如果此類兩性材料在顯示出pH梯度的介質(zhì)中暴露于適當(dāng)極性的直流電流，則它們將朝向其PI的pH區(qū)遷移，即‘聚焦’，在該處它們事實(shí)上變得被固定。因此，生成靜止的穩(wěn)態(tài)，其中混合物的所有組分均已聚焦至其各自PI。

pH梯度主要‘天然’生成，即通過電流自身生成。適當(dāng)?shù)木彌_系統(tǒng)已開發(fā)用于該目的，所述緩沖系統(tǒng)含有自身聚焦至其各自PI值的兩性組分，由此緩沖介質(zhì)的pH。

兩種變體IEF和ITP的不同之處在于IEF獲得靜止穩(wěn)態(tài)，而在ITP中，獲得遷移穩(wěn)態(tài)。因此，在IEF中，有限長度的遷移通道始終是足夠的。在ITP中，完全分辨可能需要比實(shí)際更長的遷移通道。在此類情況下，遷移組分事實(shí)上可通過施加逆流來固定，逆流的速率與樣品離子的前方遷移速率匹配。這也是本領(lǐng)域已知的。

IEF最通常在聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠中進(jìn)行，其中所有流體流動紊亂降到最低。ITP最通常在毛細(xì)管中進(jìn)行。樣品在毛細(xì)管的一端插入在前導(dǎo)者和終止者之間的界面處，并且分離組分的遷移通過在毛細(xì)管的另一端處的適當(dāng)傳感器記錄。兩種此類系統(tǒng)主要用于分析或微量制備目的。

ITP形成在相似電荷的離子之間的尖銳移動邊界。該技術(shù)可用陰離子或陽離子樣品進(jìn)行。由于不均勻的導(dǎo)電性概況，該系統(tǒng)在ITP界面處在電場中快速建立強(qiáng)梯度。根據(jù)其名稱(根據(jù)希臘語，“isos”意指“相等”，“takhos”意指“速度”)，由于不均勻的電場和電流的恒定(這是所謂的“ITP條件”)，TE和LE離子以相同的均勻速度行進(jìn)。

ITP界面是自銳性的：擴(kuò)散到TE區(qū)帶內(nèi)的LE離子經(jīng)歷強(qiáng)恢復(fù)流量并且回到前導(dǎo)區(qū)帶(并且反之對于LE區(qū)帶中的TE離子亦然)。如果樣品離子在TE區(qū)帶中的有效遷移率大于TE共離子的有效遷移率，并且如果樣品離子在LE區(qū)帶中的有效遷移率大于LE共離子的有效遷移率，則它們在該界面處聚焦。ITP的自銳性和聚焦特性促成該技術(shù)的堅(jiān)固性，并且使得ITP對于界面的紊亂(例如由于壓力驅(qū)動的流動或幾何學(xué)中的變化，例如收縮、擴(kuò)展和轉(zhuǎn)動)是相對不敏感的。

在峰模式ITP中，樣品離子濃度總是顯著低于LE和TE離子濃度，并且因此促成忽略不計(jì)至局部的導(dǎo)電性。樣品離子的分布由鄰近區(qū)帶(此處為TE和LE)之間的自銳性界面和相對于這些區(qū)帶的樣品有效遷移率值決定。多種樣品離子在與大型重疊峰相同的狹窄ITP界面區(qū)內(nèi)聚焦。

發(fā)明內(nèi)容

在一個實(shí)施例中，本發(fā)明提供了包括下述的系統(tǒng)：肽核酸(PNA)分子；DNA分子，RNA分子或其組合；和等速電泳(ITP)系統(tǒng)。在一些實(shí)施例中，PNA分子是標(biāo)記的。在一個實(shí)施例中，標(biāo)記是熒光標(biāo)記。