[發明專利]一種測定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法

有效

• 申請號: 201410406752.8
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104181243A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 劉波;駱俊清;魏嵐;武朝松;宛燕飛
• 申請（專利權）人: 成都利爾藥業有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種測定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，尤其是一種基于氣相色譜的表征甘露聚糖肽含量的方法，屬于檢測技術領域。

背景技術

甘露聚糖肽(Mannatide)曾用名：多抗甲素(PolyactinA，PAA)，是由α-溶血性鏈球菌(alpha-Hemolytic?streptococci)33#菌株經發酵培養，提取制備的多糖類物質。它具有抑制腫瘤細胞生長與代謝，促進造血干細胞生長，增強免疫細胞活化增殖及特異抗體生成，提高外周血白細胞數，改善機體抗應激能力及抗炎等多種生理活性。該藥作為治療腫瘤的輔助藥物，能夠減輕放、化療的毒副作用，增強和調節免疫功能；對貧血、血細胞減少癥、過敏性關節炎、多種口腔粘膜病等非腫瘤疾病都有很好的治療效果。

甘露聚糖肽不僅可以治療人體的多種疾病，在畜牧生產中合理運用該藥品，也可以起到很好的效果，具有光明的市場前景。但在發酵生產當中，對發酵情況的監控多依靠對發酵液中菌體的形態學觀察及發酵時間等經驗值，缺乏對發酵情況的有效評估質量標準，而以發酵產物甘露聚糖肽，含量作為質量標準是一種可行的方案。甘露聚糖肽可以分解為堿性多肽和甘露聚糖兩部分，甘露聚糖肽經水解后測得含甘露糖含量為87.7-90.3％，根據甘露聚糖的特性可對發酵產物進行檢測以表征甘露聚糖肽的含量。馮鎖民利用Molisch反應使甘露糖與α-萘酚顯色形成橙紅色物，在490nm處檢測甘露糖吸收度表征產物含量，但是培養基中添加的其他還原糖也會與α-萘酚發生顯色反應，從而干擾測定結果。張運濤建立了紫外分光法直接測定啤酒酵母中甘露糖含量的方法。甘露糖在90％H₂SO₄溶液中脫水生成5-羥甲基-2-呋喃醛，添加NaCl-H₃BO₃，使5-羥甲基-2-呋喃醛轉化為5-氯甲基-2-呋喃醛，此轉化量與甘露糖的量呈線性關系，測定前后兩次在280nm處的吸光值之差，得出甘露糖含量。

然而，發酵液成分較復雜，可能含有其他有紫外吸收的物質對甘露糖的含量測定有干擾，有很大局限性，不能準確反應甘露聚糖的含量。為此，本發明通過先對發酵液進行粗提純，甘露聚糖的酸解，衍生化及氣相色譜(GC)分離-氫火焰離子鑒定器(FID)檢測發酵液中甘露糖單體含量，排除其他單糖因素的干擾，表征產物甘露聚糖肽的含量，為發酵過程的實時監控提供有據可依的數據。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種準確可靠、較簡便且有應用價值的測定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，是對甘露聚糖肽進行酸解獲得甘露糖單體，再將甘露糖單體進行衍生化，利用氣相色譜檢測甘露糖含量，進而表征甘露聚糖肽的含量。

所述甘露聚糖肽的含量(％)＝甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)，所述百分比為質量百分比。

所述酸解是將甘露聚糖肽用1-2M?H₂SO₄于105℃進行酸解反應，1M與2M?H₂SO₄可以達到同樣的水解效果，反應結束后加入肌醇內標、混勻，用BaCO₃分次加入中和，振蕩、離心取上清液，進行冷凍干燥。所述甘露聚糖肽經過粗純化，去除分子量小于10KD及大于100KD的雜質。

所述甘露糖單體的衍生化，是稱取10mg鹽酸羥胺溶于0.5mL吡啶中，再將甘露聚糖肽酸解產物的凍干物加入到鹽酸羥胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min。

所述氣相色譜檢測甘露糖含量的條件是：

色譜柱：OV1701石英毛細管柱，30m，I.D.0.53mm；

檢測器：FID(氫火焰離子鑒定器)；

氣化室溫度：260℃，檢測器溫度：250℃；

柱溫：程序升溫：起始溫度120℃，保持3min，每分鐘升10℃，至195℃，保留0.1min，每分鐘升3℃，至240℃，保留10min；

載氣壓力(N₂)：0.60kg/cm²；

燃氣壓力(H₂)：0.65kg/cm²；

助燃氣壓力(空氣)：0.50kg/cm²；

分流比為30∶1。

所述方法應用于測定發酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的步驟為：