[發明專利]一種測定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法

有效

• 申請號: 201410406752.8
• 申請日: 2014-08-19
• 公開（公告）號: CN104181243A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 劉波;駱俊清;魏嵐;武朝松;宛燕飛
• 申請（專利權）人: 成都利爾藥業有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 張勇

1.一種測定甘露聚糖肽中甘露糖含量的方法，是對甘露聚糖肽進行酸解、衍生化獲得甘露糖單體，再將甘露糖單體進行衍生化，通過氣相色譜檢測甘露糖含量，進而表征甘露聚糖肽的含量。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酸解是將甘露聚糖肽用1-2M?H₂SO₄于105℃進行酸解反應，反應結束后用BaCO₃分次加入中和，振蕩、離心取上清液，加入肌醇內標、混勻，進行冷凍干燥。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述甘露聚糖肽經過粗純化，去除分子量小于10KD及大于100KD的雜質。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述甘露糖單體的衍生化，是稱取10mg鹽酸羥胺溶于0.5mL吡啶中，再將甘露聚糖肽酸解產物的凍干物加入到鹽酸羥胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述氣相色譜檢測甘露糖含量的氣相色譜條件是：

色譜柱：OV1701石英毛細管柱，30m，I.D.0.53mm；

檢測器：氫火焰離子鑒定器；

氣化室溫度：260℃，檢測器溫度：250℃；

柱溫：程序升溫：起始溫度120℃，保持3min，每分鐘升10℃，至195℃，保留0.1min，每分鐘升3℃，至240℃，保留10min；

載氣壓力：0.60kg/cm²，載氣為N₂；

燃氣壓力：0.65kg/cm²，燃氣為H₂；

助燃氣壓力：0.50kg/cm²，助燃氣為空氣；

分流比為30∶1。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，發酵液中甘露聚糖肽中甘露糖含量的測定步驟為：

(1)發酵產物的粗提純：量取發酵液20-30mL于50mL離心管中，10000rpm離心20min，去沉淀取上清液，轉至100KD超濾管，5000g離心20min，收集流出液，再加5mL去離子水至100KD超濾管，5000g離心20min，重復一次，合并流出液；將流出液轉移至10KD超濾管中，7500g離心20min，截留液轉移至新離心管，用去離子水多次沖洗10KD超濾管，合并截留液，將截留液進行冷凍干燥；

(2)甘露聚糖肽的酸解：稱取20mg凍干物于15mL離心管中，加2mL1M?H₂SO₄于105℃反應8h，反應后每管添加1mL1mg/mL的肌醇內標，混勻，稱取2g?BaCO₃分兩次加入中和，振蕩，12000rpm離心20min，取上清液于新1.5mL離心管中，進行冷凍干燥；

(3)酸解樣品的衍生化：稱取10mg鹽酸羥胺溶于0.5mL吡啶中，再將凍干物加入到鹽酸羥胺溶液中，充分溶解，90℃水浴30min，冷卻至室溫，加入0.5mL乙酸酐，90℃水浴30min，冷卻后進行氣相色譜分析；

(4)氣相色譜條件：

色譜柱：OV1701石英毛細管柱，30m，I.D.0.53mm；

檢測器：氫火焰離子鑒定器；

氣化室溫度：260℃，檢測器溫度：250℃；

柱溫：程序升溫：起始溫度120℃，保持3min，每分鐘升10℃，至195℃，保留0.1min，每分鐘升3℃，至240℃，保留10min；

載氣壓力：0.60kg/cm²，載氣為N₂；

燃氣壓力：0.65kg/cm²，燃氣為H₂；

助燃氣壓力：0.50kg/cm²，助燃氣為空氣；

分流比為30∶1；

(5)單糖結果分析：

單糖組分比例以肌醇為內標，以內標法測定出甘露糖含量，甘露聚糖肽的含量(％)＝甘露糖含量(％)/甘露聚糖肽中甘露糖含量(％)。