[發明專利]基于磁性分離和量子點標記的人肺炎支原體快速檢測方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201410406387.0
• 申請日: 2014-08-18
• 公開（公告）號: CN105203768B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 胡征;楊波;董俊
• 申請（專利權）人: 董俊
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所42001
• 代理人: 余曉雪,王敏鋒

技術領域

本發明涉及醫學檢測技術領域，具體為一種基于磁性分離和量子點標記的檢測人肺炎支原體抗原的快速檢測方法及檢測試劑盒，以及該檢測試劑盒的制備及使用方法。

背景技術

肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae，Mp)是人類支原體肺炎的病原體，主要經飛沫傳染，潛伏期2-3周，發病率以青少年最高。Mp感染在小兒肺炎病原的發生率高達10-30％，近年來逐漸成為小兒感染呼吸道疾病的主要病原體之一。該病極易引發咽炎、扁桃體炎等呼吸道感染，甚至可能同時繼發腦膜炎、肝炎、心肌炎等多臟器損傷，嚴重時也可導致患兒死亡。

由于Mp感染與其它病原體引起的呼吸道感染癥狀類似，不做病原學檢查，很難將Mp與其它病原體引起的呼吸道感染相區別。Mp無細胞壁，常用的β-內酰胺類藥物對其無效，故其引起的感染的治療與其它細菌和病毒感染的治療方案完全不同，因此建立簡便、快速、可行、能早期診斷肺炎支原體感染的方法非常必要。

目前Mp的檢測方法主要有3類：一是分離培養法，其是證實感染的“金標準”，但由于Mp的生長周期極為緩慢，培養周期長，導致該法在臨床上不能進行快速診斷；二是血清學方法，即采用酶聯免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗等，檢測被檢者血清中Mp抗體水平，可間接提示Mp感染的存在。然而，血清學試驗只能提供一種回顧性的診斷，而且有時需要雙份血清。另外，抗體出現的時機不易掌握，兒童、青少年與成人之間又存在Mp特異性抗體的差異，并且，Mp細胞膜上的糖脂抗原與其他微生物及機體組織存在非特異性交叉反應，故現有血清學方法的檢測質量受到一定限制；三是利用分子生物學技術檢測MpDNA的存在，其中最常用的是聚合酶鏈式反應(PCR)，該方法快速、靈敏、特異，是目前研究人肺炎支原體感染的重要手段，但由于PCR對實驗設備以及操作要求較高，且易出現假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。因此，建立人肺炎支原體特異性抗原診斷方法十分必要。目前，已公開報道的檢測人肺炎支原體抗原的方法主要為雙抗夾心ELISA法、量子點標記免疫層析法、間接免疫熒光法等，但這些方法雖然靈敏度較高，但是由于人肺炎支原體在臨床標本如咽拭子中的含量極低，導致其臨床檢測陽性率還是較低，目前均未進行臨床實際應用。

發明內容

針對背景技術中存在的這些技術問題，本發明提供了一種基于磁性分離和量子點標記的能簡便、快速、高靈敏度的檢測人肺炎支原體抗原的檢測方法和試劑盒，以及該試劑盒的制備及使用方法。

本發明是通過以下技術方案來實現的：

一種基于磁性分離和量子點標記的檢測人肺炎支原體抗原的方法，其特征在于：所述該方法包括以下步驟：

1)兔抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體的制備；

2)鼠抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體的制備；

3)將步驟1)制備得到的兔抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體與納米磁珠通過共價偶聯，制備抗人肺炎支原體免疫納米磁珠；

4)將步驟2)制備得到的鼠抗人肺炎支原體P1蛋白多克隆抗體與納米量子點通過共價偶聯，制備量子點標記的抗人肺炎支原體納米探針；

5)取人呼吸道分泌物樣本(包括但不限于咽拭子)，用PBST緩沖液溶解后，加入步驟3)制備得到的抗人肺炎支原體免疫納米磁珠，充分混合，反應25-45min后進行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點標記的抗人肺炎支原體納米探針，反應25-45min后進行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使用熒光酶標儀讀取熒光值；所述PBST緩沖液中各成分含量如下：8g/LNaCL，0.2g/LKCl，0.24g/LKH₂PO₄，1.44g/LNa₂HPO₄，0.5ml/LTween-20，所述PBST緩沖液的pH＝7.4；

6)根據步驟1)-步驟5)的方法分別檢測四份經臨床確定為人肺炎支原體陰性的人群的呼吸道分泌物樣品，讀取熒光值；所述人肺炎支原體陰性的人群的呼吸道分泌物樣品簡稱人肺炎支原體陰性對照樣品；所述四份人肺炎支原體陰性對照樣品的熒光值的平均值與3倍標準差之和即為CUT-OFF值；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測熒光值大于CUT-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎支原體抗原為陽性；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測熒光值小于CUT-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎支原體抗原為陰性。