[發明專利]一種檢測肺炎鏈球菌的LAMP引物組、試劑盒和方法

有效

• 申請號: 201410406124.X
• 申請日: 2014-08-18
• 公開（公告）號: CN104164508A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 郭旭光;夏勇;江鏡全;陳瓊;劉美玲;唐曉華
• 申請（專利權）人: 廣州醫科大學附屬第三醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12N15/11;C12R1/46
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;宋靜娜

技術領域

本發明涉及一種引物組，具體涉及一種檢測肺炎鏈球菌的LAMP引物組、試劑盒和方法。

背景技術

肺炎鏈球菌(Streptococcus?pneumoniae,SP)普遍定植于人類呼吸道，是重要的侵襲性病原菌之一，是社區獲得性肺炎、中耳炎、鼻竇炎、腦膜炎、菌血癥等疾病的主要致病菌，其引起的腦膜炎和菌血癥死亡率高，約為30—40％和15—24％。肺炎鏈球菌主要感染2歲以下幼兒及65歲以上老年人，是導致兒童死亡的最重要原因之一，世界衛生組織(World?Health?Organization,WHO)估計每年約有160萬人死于肺炎鏈球菌感染，其中70～100萬為5歲以下兒童。而且肺炎鏈球菌耐藥現象越來越嚴重，給人類健康帶來嚴重的威脅。肺炎鏈球菌的快速診斷是一個系帶解決的問題。

2000年Notomi等開發出的一種新的DNA檢測技術環介導恒溫擴增技術，之后Nagamine等研究表明，通過設計兩條環引物可使反應速度提升1/3-1/2，目前該方法已經在多種細菌及病毒的檢測方面均已建立了相關成熟的方法，并具有較高的應用價值。2011年Naomi首次報將實時熒光LAMP(Rea-LAMP)技術用于瘧疾的診斷，其檢測的敏感度為96.7％，特異度為91.7％。實時熒光LAMP技術是在實時熒光PCR技術和傳統LAMP技術的基礎上開發的一種新的核酸檢測技術。該技術克服了傳統PCR固有的檢測時間長、容易污染及檢測成本高等缺點。由于該技術檢測的是熒光信號，其檢測敏感性顯著提高且在極大程度上縮短了檢測時間。熒光定量LAMP技術是一種便捷、靈敏、特異性高的快速檢測基因方法，該技術一旦應用臨床將會在感染性疾病的早期診斷中發揮重要作用，同時精確的量化能為臨床治療起到指導作用。在疾病的預防控制中可起到早期檢測預防疾病擴散的作用。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種檢測肺炎鏈球菌的LAMP引物組、試劑盒、方法，以及該LAMP引物組在檢測肺炎鏈球菌中的用途。

為實現上述目的，所采取的技術方案：一種檢測肺炎鏈球菌的LAMP引物組，包括以下引物：

外引物F3:GGCTCTACTGTGAATTCTGG(SEQ?ID:NO.1)；

外引物B3:GGCAACTGGTACTGGTTC(SEQ?ID:NO.2)；

內引物FIP:TATCCAGTCAGCGGACGGACTTGTCTGCCAGTGTTCC(SEQID:NO.3)；

內引物BIP:

GCGCCTTCTTTAGCGTCTAAGTAACGAAGAAGGTGCCATG(SEQ?ID:NO.4)。

優選地，所述LAMP引物組還包括：

環引物FLP:ACAGGCTGGTACTACCTCA(SEQ?ID:NO.5)；

環引物BLP:GTACTTGACCCAGCCTGTC(SEQ?ID:NO.6)。

本發明所述LAMP引物組中加入上述環引物后，使反應出峰時間明顯縮短，進而使得整個反應時間縮短。

本發明還提供了一種檢測肺炎鏈球菌的試劑盒，所述試劑盒包括上述所述的LAMP引物組。

優選地，所述試劑盒還包括反應液、顯色劑、Bst大片斷DNA聚合酶、陽性對照品、陰性對照品和超純水；所述反應液包括Tris-HCl(PH8.8)、KCl、MgSO₄、(NH₄)₂SO₄、Tween20、甜菜堿以及dNTP。

優選地，所述試劑盒中所述內引物FIP和BIP各1.6μM，所述外引物F3和B3各0.2μM，所述試劑盒中所述反應液包括20mM?Tris-HCl(PH8.8)、10mM?KCl、8mM?MgSO₄、10mM(NH₄)₂SO₄、0.1％Tween20、1M甜菜堿以及1.6mM?dNTP，所述試劑盒中所述Bst大片斷DNA聚合酶濃度為8U/μL；