[發明專利]多形漢遜酵母突變菌株及多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法

有效

• 申請號: 201410404466.8
• 申請日: 2014-08-15
• 公開（公告）號: CN104195059A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 錢衛東;王婷;毛培宏;寧肖肖
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12P7/18;C12R1/78
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

1.一種多形漢遜酵母突變菌株，其特征在于：該突變菌株為酸性磷酸酯酶基因突變菌株，酸性磷酸酯酶基因突變導致突變菌株的酸性磷酸酯酶活性消失。

2.根據權利要求1所述一種多形漢遜酵母突變菌株，其特征在于：所述突變菌株為敲除了酸性磷酸酯酶基因的多形漢遜酵母DL-1。

3.一種多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)利用基因敲除方法構建一株多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因突變菌株，該突變菌株的酸性磷酸酯酶活性消失；

2)采用葡萄糖分批補料發酵的方法，利用所述突變菌株生物轉化生產D-阿拉伯糖醇。

4.根據權利要求3所述一種多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所述步驟1)具體包括以下步驟：

a)構建基因敲除質粒pMD18-PHO-kanMX，pMD18-PHO-kanMX的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，以pMD18-PHO-kanMX為模板，并分別采用PHO-L-U和pUG6-D組成的引物對以及pUG6-U和PHO-R-D組成的引物對，利用PCR方法擴增酸性磷酸酯酶基因敲除片段，PHO-L-U的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，pUG6-D的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，pUG6-U的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，PHO-R-D的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，將所述敲除片段采用電穿孔法轉化多形漢遜酵母DL-1；

b)利用高磷培養基顯色篩選法從轉化后的多形漢遜酵母DL-1中獲得初篩菌株，然后以初篩菌株基因組為模板，并分別采用PHO-Y-U和pUG6-D組成的引物對以及pUG6-U和PHO-Y-D組成的引物對，利用PCR方法篩選突變菌株，當采用PHO-Y-U和pUG6-D組成的引物對以及pUG6-U和PHO-Y-D組成的引物對均擴增出片段時，所對應的初篩菌株為突變菌株，PHO-Y-U的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示，PHO-Y-D的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示。

5.根據權利要求4所述一種多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所述高磷培養基的組成包括5g/L的硫酸銨、100g/L的葡萄糖、0.5g/L的硫酸鎂，0.1g/L的氯化鈣、500μg/L的硼酸、40μg/L的硫酸銅，100μg/L的碘化鉀，200μg/L的氯化鐵，400μg/L的硫酸錳、200μg/L的鉬酸銨、400μg/L的硫酸鋅、500mg/L的磷酸二氫鉀以及15g/L的瓊脂；高磷培養基顯色篩選的顯色劑的制備方法為：將α-萘酚磷酸鹽、固藍鹽B和瓊脂溶解于0.05mol/L醋酸水溶液中得混合物，混合物中α-萘酚磷酸鹽的濃度為5mg/mL，固藍鹽B的濃度為50mg/mL，瓊脂的濃度為10mg/mL，依據高磷培養基上菌落顏色變化，挑選出白色菌落，得初篩菌株。

6.根據權利要求3所述一種多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所述步驟2)具體包括以下步驟：

種子培養：將突變菌株接種于種子培養基中并于28～37℃以及100～200r/min條件下培養14～24h得種子液；

發酵培養：將種子液接種于發酵培養基中并于28～37℃以及100～200r/min條件下連續培養，發酵培養基含有生物轉化的底物葡萄糖，連續培養期間分批補加葡萄糖。

7.根據權利要求6所述一種多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所述種子培養基的組成包括4～10g/L的酵母浸粉、10～20g/L的葡萄糖以及10～20g/L的蛋白胨。

8.根據權利要求6所述一種多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于：所述發酵培養基的組成包括5～10g/L的酵母浸粉、10～20g/L的葡萄糖、10～20g/L的蛋白胨，0.5～2.5g/L的硫酸鎂，1～3g/L的磷酸二氫鉀，0.1～0.5g/L的氯化鈣以及0.75～3.75g/L的硫酸銨，種子液接種于發酵培養基后連續培養96～144h，連續培養期間每隔24～28h補加50～60g/L的葡萄糖。