[發明專利]多形漢遜酵母突變菌株及多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法

有效

• 申請號: 201410404466.8
• 申請日: 2014-08-15
• 公開（公告）號: CN104195059A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 錢衛東;王婷;毛培宏;寧肖肖
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12P7/18;C12R1/78
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

技術領域

本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及利用基因敲除方法敲除多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因而構建的突變菌株，并利用該突變菌株通過生物轉化法生產D-阿拉伯糖醇。

背景技術

D-阿拉伯糖醇是一種五碳糖醇，分子式為C₅H₁₂0₅，分子量為152.12，是木糖醇和核糖醇的同分異構體。它是一種有甜味的白色晶體，其熔點為103℃，旋光度為130°，在空氣中有很強的吸濕性。糖醇是經糖還原的一類多元醇，由于具有低熱值、抗齲齒、不影響胰島素水平等優點，其在醫藥、食品、化工等領域具有重要的應用價值。

在食品領域中，D-阿拉伯糖醇可用作改善酒精飲料品質的添加劑和調制糖漿的基質；在化工領域中，D-阿拉伯糖醇可用作影響高分子發泡材料合成過程的激活劑、保護顯影材料置于高溫環境長期保存的穩定劑、提高鋁電容器高溫可靠性及其電解質溶液粘度的增強劑和提高親水涂層或顆粒性固體溶解的輔助劑等；在醫藥領域中，D-阿拉伯糖醇可作為藥物中間體用于生產1,4-二脫氧-1,4-亞胺基-D-阿拉伯糖醇，可作為α-葡萄糖苷酶的抑制劑，也可用于防治艾滋病。

目前，常規生產D-阿拉伯糖醇的方法主要是通過化學法合成，通過還原D-阿拉伯糖或來蘇糖得到。但是該方法反應過程復雜、設備要求高、環境污染嚴重、底物昂貴，致使D-阿拉伯糖醇不能規模化生產。針對化學合成法的缺點，通過生物轉化法生產D-阿拉伯糖醇，其反應條件溫和、生產工藝簡單，因而從長遠考慮，該方法最有潛力。生物轉化法是將細胞生長一定的濃度后添加底物(葡萄糖)，利用細胞中的酶系反應合成D-阿拉伯糖醇，該方法產物單一、提取簡單、對反應設備和條件要求低。

截止目前，可用于生產D-阿拉伯糖醇的菌株，主要包括曲霉菌屬(Aspergillus)、假絲酵母屬(Candida)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、擬內袍霉屬(EndomycoPsis)、小叢梗袍屬(Moniliella)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤母屬(pichia)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。值得注意的是，漢遜酵母屬中多形漢遜酵母(Hansenula?polymorpha)是當前國際公認的理想細胞工廠(Gellsissen，kunze?et?al.2005)。多形漢遜酵母最適生長溫度高(37～43℃)，生長速率快，易于大規模高密度發酵，易于培養，能在廉價培養基中高密度生長。但是，大部分產D-阿拉伯糖醇的酵母菌株對底物葡萄糖的轉化率較低，多數酵母菌株的轉化葡萄糖產D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的轉化率介于10％～40％之間，并且普遍存在甘油及其他多元醇副產物。

酵母的酸性磷酸酯酶(acid?phosphatase，PHO1)參與無機磷的輸送，當該酶缺失時，胞內的磷質量濃度不夠，使糖酵解途徑中的關鍵酶的活性受到影響，因而不能利用葡萄糖產甘油。因此，當酸性磷酸酯酶缺失時，培養基中葡萄糖可以主要用于D-阿拉伯糖醇的轉化生產(曹鈺等.1999)。

發明內容

本發明的目的在于提供一種多形漢遜酵母突變菌株以及多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種多形漢遜酵母突變菌株，該突變菌株為酸性磷酸酯酶基因(PHO1，GenBank?Accession?NO.AF051161)突變菌株，酸性磷酸酯酶基因突變導致突變菌株的酸性磷酸酯酶活性消失。

所述突變菌株為敲除了酸性磷酸酯酶基因的多形漢遜酵母DL-1(ATCC?No.26012)。

一種多形漢遜酵母生產D-阿拉伯糖醇的方法，包括以下步驟：

1)利用基因敲除方法構建一株多形漢遜酵母酸性磷酸酯酶基因突變菌株，該突變菌株的酸性磷酸酯酶活性消失；

2)采用葡萄糖分批補料發酵的方法，利用所述突變菌株生物轉化生產D-阿拉伯糖醇。

所述步驟1)具體包括以下步驟：