[發(fā)明專利]系列廣譜抗菌肽的制備、純化、鑒定及其用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410402969.1
• 申請(qǐng)日: 2014-08-15
• 公開（公告）號(hào): CN105330722A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾靜;趙志遠(yuǎn);其他發(fā)明人請(qǐng)求不公開姓名
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖南唯創(chuàng)前沿科技有限公司;湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K7/06
• 分類號(hào): C07K7/06;A01P1/00;A01P3/00;C12P21/02;C07K1/20;C07K1/18;C12R1/01
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明為一種短短芽孢桿菌X23外泌新型非核糖體抗菌肽Edeine家族同系物及其發(fā)酵制備，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，本發(fā)明涉及新型非核糖體抗菌肽的微生物發(fā)酵、純化、鑒定及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

短短芽孢桿菌是芽孢桿菌屬的一個(gè)種，菌體呈短桿狀，細(xì)胞壁厚，廣泛分布于自然界。該菌在生長(zhǎng)過(guò)程中可以向外界分泌種類豐富、數(shù)量可觀的蛋白質(zhì)和非核糖體肽（non-ribosomalpeptide,NRPs）等次生代謝產(chǎn)物。

NRPs由非核糖體肽合成酶(non-ribosomalpeptidesynthetases,NRPSs)催化合成。NRPSs是由多個(gè)酶按模塊化(module)組成的大的復(fù)合體，每個(gè)酶含一個(gè)或多個(gè)模塊，每個(gè)模塊激活一個(gè)特定的氨基酸并將其整合到新生的肽鏈中(GrünewaldandMarahiel,2006)。典型的模塊由腺苷酰化結(jié)構(gòu)域(A結(jié)構(gòu)域)、巰基化結(jié)構(gòu)域(T結(jié)構(gòu)域)和縮合結(jié)構(gòu)域(C結(jié)構(gòu)域)等三個(gè)核心結(jié)構(gòu)域組成，模塊的數(shù)量、排列順序和方向與其產(chǎn)物的氨基酸數(shù)量、排列順序和方向之間存在嚴(yán)格的共線性關(guān)系，如短桿菌酪肽(tyrocidine)等。此后還發(fā)現(xiàn)了另外2種合成NRPs的方式：iterativeNRPSs和nonlinearNRPSs。IterativeNRPSs是指同一個(gè)模塊或結(jié)構(gòu)域在肽鏈合成過(guò)程中不止一次地往新生肽鏈上重復(fù)激活和添加某個(gè)氨基酸，導(dǎo)致肽鏈由多個(gè)小的重復(fù)序列組成；NonlinearNRPSs方式合成的肽鏈順序與其合成酶的模塊之間并不存在嚴(yán)格的共線性關(guān)系(Mootzetal.,2002)。在NRPSs的最后一個(gè)模塊的C-末端通常有起終止延伸和釋放產(chǎn)物功能的硫酯(thioesterase,TE)結(jié)構(gòu)域。除了上述核心結(jié)構(gòu)域，在同一個(gè)模塊內(nèi)可能還存在一些附加的結(jié)構(gòu)域，如差向異構(gòu)結(jié)構(gòu)域(E結(jié)構(gòu)域)和甲基化結(jié)構(gòu)域(M結(jié)構(gòu)域)等，它們?cè)陔逆満铣蛇^(guò)程中對(duì)氨基酸底物進(jìn)行修飾；乙酰化、糖基化和脂質(zhì)化等結(jié)構(gòu)域則對(duì)肽鏈骨架進(jìn)行修飾。如果不具有這些結(jié)構(gòu)域，修飾作用則由獨(dú)立于NRPSs的酶催化完成(Schwarzeretal.,2003;GrünewaldandMarahiel,2006)。

NRPs在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和生物學(xué)等領(lǐng)域具有極大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用潛力，除了可以殺死或抑制病原菌，NRPs還被廣泛用于抗腫瘤和抑制免疫反應(yīng)等(CoppingandDuke,2007)。目前臨床應(yīng)用最多的10種抗生素類產(chǎn)品中有8種為NRPs(Saleemetal.,2010)，在抗感染和抗腫瘤等領(lǐng)域的市場(chǎng)份額分別達(dá)到了68.3%和79.8%(Craggetal.,2009)。NRPs也可以抑制或殺死作物病原微生物，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域也具有良好的應(yīng)用潛力。因此，NRPs的分離、鑒定和應(yīng)用是當(dāng)前天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)之一，預(yù)示該非核糖體抗菌肽在治療和預(yù)防癌癥和抗病毒方面具有良好的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及非核糖體抗菌肽Edeine家族的制備、純化、鑒定及其應(yīng)用。

短短芽孢桿菌X23是一種能分泌對(duì)多種病原微生物具有抑制殺傷作用的非核糖體抗菌肽的根際微生物。這些非核糖體抗菌肽具有熱穩(wěn)定性高、耐受蛋白酶水解的能力強(qiáng)和不易誘導(dǎo)靶標(biāo)微生物產(chǎn)生選擇性抗性等特點(diǎn)。由于此類抗菌肽通常以多種結(jié)構(gòu)類似物的形式共同存在于其發(fā)酵液中，并且有環(huán)狀結(jié)構(gòu)和非編碼氨基酸。

X23發(fā)酵液的制備

將冷凍保存的短短芽孢桿菌X23菌種接種于裝有NB或LB培養(yǎng)基的三角瓶中，25℃--30℃過(guò)夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，即為發(fā)酵培養(yǎng)的種子液。將該種子液接種于新鮮的液體培養(yǎng)基，得到X23的發(fā)酵液；X23發(fā)酵液經(jīng)高速離心后，取上清液經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾，徹底去除菌體，得到無(wú)菌發(fā)酵液，減少了后續(xù)處理中因殘留菌體破裂、胞內(nèi)蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)對(duì)非核糖體抗菌肽分離純化的干擾。

X23非核糖體抗菌肽粗制備液

取上一步驟制備的X23無(wú)菌發(fā)酵液，濃縮后用等體積氯仿抽提，高速離心后收集上層水相；再經(jīng)80℃水浴后高速離心，棄沉淀，上清液即為X23非核糖體抗菌肽的粗制備液。其有益效果是為了簡(jiǎn)化樣品組成。

X23非核糖體抗菌肽的富集

為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化樣品組成，并富集非核糖體抗菌肽，將粗制備液經(jīng)弱陽(yáng)離子交換樹脂處理。其有益效果是樣品被大大簡(jiǎn)化，同時(shí)也為工業(yè)化生產(chǎn)工藝的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

X23非核糖體抗菌肽的高效制備液相色譜分離

將非核糖體抗菌肽粗品進(jìn)一步利用硅膠基質(zhì)C8或C18作為反相固定相，采用高壓制備液相色譜對(duì)目標(biāo)峰進(jìn)行制備，得到高純度Edeine家族同系物。