[發明專利]系列廣譜抗菌肽的制備、純化、鑒定及其用途

在審

• 申請號: 201410402969.1
• 申請日: 2014-08-15
• 公開（公告）號: CN105330722A
• 公開（公告）日: 2016-02-17
• 發明（設計）人: 曾靜;趙志遠;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 湖南唯創前沿科技有限公司;湖南農業大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;A01P1/00;A01P3/00;C12P21/02;C07K1/20;C07K1/18;C12R1/01
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1.一系列由短短芽孢桿菌X23菌株(BrevibacillusbrevisX23)合成并分泌的非核糖體抗菌肽，是非核糖體抗菌肽Edeine家族的同系物，其特征在于具有如下的氨基酸序列：(S)-Phe-(S)-Les-(S)-A₂pr-(2R,6S,7R)-A₂ha-Gly-Gsper、(S)-Tyr-(S)-Les-(S)-A₂pr-(2R,6S,7R)-A₂ha-Gly-Gsper、(S)-Phe-(S)-Les-(S)-A₂pr-(2R,6S,7R)-A₂ha-Gly-Sper、(S)-Tyr-(S)-Les-(S)-A₂pr-(2R,6S,7R)-A₂ha-Gly-Sper。

2.權利要求書1所述非核糖體抗菌肽Edeine家族的制備、純化、鑒定方法，其特征在于，包括：

步驟一：將冷凍保存的短短芽孢桿菌X23菌種接種于裝有培養基的三角瓶中，培養即得發酵培養的種子液，再將該種子液接種于新鮮的液體培養基，得到X23的發酵液；

步驟二：去除X23發酵液中菌體等固體雜質，得到無菌發酵液；

步驟三：將無菌發酵濃縮后經有機溶劑抽提，收集水相，高溫處理后去除沉淀，得X23外泌非核糖體抗菌肽粗制備液；

步驟四：采用樹脂富集粗制備液中的非核糖體抗菌肽，吸附后洗脫去除非活性組分，得到非核糖體抗菌肽粗品；

步驟五：采用高效制備液相色譜對步驟四所述粗品進一步純化；

將粗品溶解后，采用疏水反相分離材料為固定相，有機溶劑和水為流動相，收集活性肽洗脫液，進一步將非核糖體抗菌肽的純度提高到>95%；

步驟六：采用高分辨質譜測定精確分子量，并結合核磁共振數據，確認系列非核糖體抗菌肽為Edeine家族同系物EdeineA、EdeineB、EdeineD、EdeineF。

3.根據權利要求書1中步驟一所述，其特征在于采用PDA、NB、NA或LB作為培養基，20℃--35℃，100-350rpm培養過夜，將該種子液以體積比5%-20%接種于新鮮的NB液體培養基，培養24h-48h，得X23發酵液；更優選的條件是采用NB或LB作為培養基，25℃--30℃，180-250rpm培養過夜，將該種子液以體積比8%-15%接種于新鮮的NB液體培養基，培養30h-40h。

4.根據權利要求書1中步驟二所述，其特征在于采用高速離心或微濾膜過濾等方式去除固體雜質。

5.根據權利要求書1中步驟三所述，其特征在于所述有機溶劑為石油醚、正己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯中的一種或幾種，更優選的是氯仿。

6.根據權利要求書1中步驟四所述，其特征在于所選用的樹脂為陽離子交換樹脂，包括強陽離子交換樹脂和弱陽離子交換樹脂，更優選的為弱陽離子交換樹脂；洗脫方法為本領域技術人員所熟知的方法。

7.根據權利要求書1中步驟五所述，其特征在于高效液相制備色譜所采用的分離材料為反相材料，包括聚合物基質反相材料和硅膠基質反相材料，更優選硅膠基質鍵合辛烷基或十八烷基的反相材料；洗脫方法為本領域技術人員所熟知的方法。

8.權利要求書1所述非核糖體抗菌肽，其特征在于，包括但不限于對真菌和細菌有殺滅作用，包括煙草青枯病菌、大腸桿菌、大白菜軟腐病菌、水稻白葉枯病菌和金黃色葡萄球菌、馬鈴薯晚疫病菌、煙草黑脛病菌和水稻稻瘟病菌等。