[發明專利]用Alu重復序列基因擴增引物且無需DNA抽提的檢測血漿游離DNA的定量PCR方法

在審

• 申請號: 201410400571.4
• 申請日: 2014-08-14
• 公開（公告）號: CN105463064A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 王曉慧
• 申請（專利權）人: 上海體育學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明旨在提供一種能反映運動員過度訓練情況的人血漿游離DNA水平的定量PCR檢測方法，該方法的擴增引物特別設計，只需一滴指尖或靜脈血、無需DNA抽提、3小時就可檢測出血漿游離DNA水平。若想數值能更準確，以及動態反應過度訓練過程，可以選擇訓練前、訓練后即刻以及訓練后的不同時間來指尖采血或靜脈抽血，檢測血漿游離DNA的水平，動態觀察和比較。

背景技術

目前檢測血漿游離DNA水平的方法有彗星檢測或稱為單細胞凝膠電泳試驗、血漿DNA的熒光定量測定和定量PCR方法。第一種方法的長處是可檢測單細胞水平的DNA損傷，但取材到的細胞不一定能反映血漿總的DNA損傷程度；第二種方法要進行血漿DNA的抽提之后才可進行，且敏感性不是很高，而第三種的定量PCR方法所選用的擴增基因有肌肉生長抑制素基因（擴增片段88bp）、β球蛋白基因（擴增片段189bp）和多位點L1PA2基因（擴增片段90bp和222bp）的擴增，盡管它們的敏感性高，但大多也需先進行血漿或血清的DNA抽提才能有較好的擴增結果。在應用中需要一種用血量少且無需進行血漿DNA抽提的測試方法。

目前，應用七大類生理指標（血睪酮水平、皮質醇水平，睪酮/皮質醇比值，晨脈，Hb水平，血尿素、血清肌酸激酶）的綜合評定來反映是否出現過度訓練及過度訓練的程度，但這些指標均沒有特異性、且常常滯后，不能早期、敏感、準確地反映運動員過度訓練情況。因此，體育界非常迫切地希望有某種分子能成為反映過度訓練的早期、敏感監測指標，并且檢測方法簡便、快速、需血量少。近年來的研究顯示，血漿游離DNA的水平是一個很好的候選分子。自1982年首次報道了運動通過增多的自由基損傷組織，引起DNA斷裂，使血中出現游離DNA（cellfreeDNA）（DaviesKJ,QuintanilhaAT,BrooksGA,etal.Freeradicalsandtissuedamageproducedbyexercise.BiochemBiophysResCommun.1982;107(4):1198-205.運動產生的自由基和組織損傷。生物化學和生物物理研究通訊。）之后，近幾年來關于運動對血漿游離DNA的影響及意義越來越受到研究者的關注。目前的研究認為不論是一次的大強度訓練（1.AtamaniukJ,VidottoC,TschanH,etal.Increasedconcentrationsofcell-freeplasmaDNAafterexhaustiveexercise.ClinChem.2004;50(9):1668-70.力竭運動后血漿游離DNA的濃度增加。臨床化學。2.AtamaniukJ,StuhlmeierKM,VidottoC,etal.Effectsofultra-marathononcirculatingDNAandmRNAexpressionofpro-andanti-apoptoticgenesinmononuclearcells.EurJApplPhysiol.2008;104(4):711-7.馬拉松對單核細胞促凋亡和抗凋亡的游離DNA和mRNA的影響。歐洲應用生理學雜志。3.BeiterT1,FragassoA,HudemannJ,etal.Short-termtreadmillrunningasamodelforstudyingcell-freeDNAkineticsinvivo.ClinChem.2011;57(4):633-636.短期的跑臺跑步運動是一個研究體內游離DNA動態變化的模型。臨床化學。4.VeldersM1,TreffG1,MachusK1,etal.ExerciseisapotentstimulusforenhancingcirculatingDNaseactivity.ClinBiochem.2014;47(6):471-474.運動是一個增強循環DNA酶活性的潛在刺激因素。臨床生化。5.AtamaniukJ,VidottoC,KinzlbauerM,etal.Cell-freeplasmaDNAandpurinenucleotidedegradationmarkersfollowingweightliftingexercise.EurJApplPhysiol.2010;110(4):695-701.舉重后的血漿游離DNA和嘌呤核苷酸降解標記物。歐洲應用生理學雜志。），還是持續一段時間（慢性）的大強度或大負荷訓練（1.FatourosIG,DestouniA,MargonisK,etal.Cell-freeplasmaDNAasanovelmarkerofasepticinflammationseverityrelatedtoexerciseovertraining.ClinChem.2006;52(9):1820-4.血漿游離DNA是一個與過度訓練有關的反映無菌性炎癥嚴重程度的新標記。運動醫學。2.BreitbachS1,TugS,SimonP.Circulatingcell-freeDNA:anup-comingmolecularmarkerinexercisephysiology.SportsMed.2012;42(7):565-86.循環中的游離DNA：一個將來的運動生理學的分子標記。運動醫學。）都可使血漿游離DNA的水平迅速（多在運動后的數分鐘到一、二小時內）升高，且增加幅度明顯（從幾倍到幾十、上百倍不等）。如果是單次的大強度運動則血漿游離DNA清除較快，通常在12小時內恢復正常，而慢性的大強度和大負荷運動則升高的游離DNA水平維持較久，從1天到十來天不等，由運動強度和負荷決定（1.FatourosIG,DestouniA,MargonisK,etal.Cell-freeplasmaDNAasanovelmarkerofasepticinflammationseverityrelatedtoexerciseovertraining.ClinChem.2006;52(9):1820-4.血漿游離DNA是一個與過度訓練有關的反映無菌性炎癥嚴重程度的新標記。運動醫學。2.BreitbachS1,TugS,SimonP.Circulatingcell-freeDNA:anup-comingmolecularmarkerinexercisephysiology.SportsMed.2012;42(7):565-86.循環中的游離DNA：一個將來的運動生理學的分子標記。運動醫學。）。已發現多種運動方式，如馬拉松（1.AtamaniukJ,VidottoC,TschanH,etal.Increasedconcentrationsofcell-freeplasmaDNAafterexhaustiveexercise.ClinChem.2004;50(9):1668-70.力竭運動后血漿游離DNA的濃度增加。臨床化學。2.AtamaniukJ,StuhlmeierKM,VidottoC,etal.Effectsofultra-marathononcirculatingDNAandmRNAexpressionofpro-andanti-apoptoticgenesinmononuclearcells.EurJApplPhysiol.2008;104(4):711-7.馬拉松對單核細胞促凋亡和抗凋亡的游離DNA和mRNA的影響。歐洲應用生理學雜志。3BeiterT1,FragassoA,HudemannJ,etal.Short-termtreadmillrunningasamodelforstudyingcell-freeDNAkineticsinvivo.ClinChem.2011;57(4):633-636.短期的跑臺跑步運動是一個研究體內游離DNA動態變化的模型。臨床化學。）、舉重（AtamaniukJ,VidottoC,KinzlbauerM,etal.Cell-freeplasmaDNAandpurinenucleotidedegradationmarkersfollowingweightliftingexercise.EurJApplPhysiol.2010;110(4):695-701.舉重后的血漿游離DNA和嘌呤核苷酸降解標記物。歐洲應用生理學雜志。）等抗阻或耐力的力竭運動會使血漿游離DNA水平增加。且血中游離DNA的水平與過度運動所致的無菌性炎癥的嚴重程度（FatourosIG,DestouniA,MargonisK,etal.Cell-freeplasmaDNAasanovelmarkerofasepticinflammationseverityrelatedtoexerciseovertraining.ClinChem.2006;52(9):1820-4.血漿游離DNA是一個與過度訓練有關的反映無菌性炎癥嚴重程度的新標記。運動醫學。）或運動強度（FogartyMC1,HughesCM,BurkeG,etal.Exercise-inducedlipidperoxidation:Implicationsfordeoxyribonucleicaciddamageandsystemicfreeradicalgeneration.EnvironMolMutagen.2011;52(1):35-42.運動誘導的脂質過氧化：DNA損傷和系統性自由基產生的含義。環境分子突變。）成正比。所以，血漿游離DNA水平被認為是現在最有希望成為反映過度訓練的指標（BreitbachS1,TugS,SimonP.Circulatingcell-freeDNA:anup-comingmolecularmarkerinexercisephysiology.SportsMed.2012;42(7):565-86.循環中的游離DNA：一個將來的運動生理學的分子標記。運動醫學。）。