[發明專利]一種檢測芒果橫線尾夜蛾PBAN基因表達特性的熒光定量PCR法

有效

• 申請號: 201410399669.2
• 申請日: 2014-08-15
• 公開（公告）號: CN104152559A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 魏輝;鄭麗禎;田厚軍;陳藝欣;林碩;常虹
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種檢測芒果橫線尾夜蛾PBAN基因表達特性的熒光定量PCR法，特別涉及在不同的組織部位檢測芒果橫線尾夜蛾PBAN基因表達量的高效快捷熒光定量PCR法。

背景技術

昆蟲信息素生物合成激活神經肽(pheromone?biosynthesis?activating?neuropeptide，PBAN)是一種重要的昆蟲神經肽，在成蟲的腦-食道下神經節（SG）合成，暫時儲存在心側體，在受到相應的刺激時釋放出來，能調節昆蟲性信息素的生物合成與釋放。Raina等研究發現棉鈴蟲性行為受到激素物質的調控，并從棉鈴蟲腦-咽下神經節復合體中分離出PBAN。隨后，Kitamura等從家蠶的頭部分離純化得到兩個活性肽，分別命名為Bom-PBAN?Ⅰ和Bom-PBAN?Ⅱ。

PBAN基因在鱗翅目昆蟲中廣泛存在，Xu等從煙草天蛾的咽下神經節中克隆出DH-PBAN基因，該基因在滯育與非滯育蟲體的蛹期表達量存在差異。Li等首次成功克隆了沙棘木蠹蛾的PBAN基因，該基因在腦-咽下神經節中表達量最高，同時證明該基因的表達可能與幼蟲的生長及雌蛾性信息素的生物合成有關。Choi和Vander首次從紅火蟻中克隆出PBAN家族中的新基因，該基因中α-神經肽缺失，研究表明PBAN基因的差異與昆蟲的種類相關。

PBAN是由腦-咽下神經節合成和分泌的，而不同組織中PBAN的表達存在差異。Xu等將1日齡的煙草天蛾分為頭、咽下神經節、胸神經節、腹神經節、中腸和馬氏管等組織分析PBAN在不同組織中的表達，結果表明咽下神經節中的表達量最高，其次是胸神經節，頭部、腹神經節和非神經組織中無表達。Lee和Boo將1日齡的小菜蛾雌蟲和雄蟲分別分為頭、胸部和腹部三部分分析PBAN的表達差異，研究表明在雌蟲和雄蟲的不同部位均存在PBAN基因的表達。Chen等將小菜蛾雌蟲分為頭-咽下神經節、腹神經索、性腺和卵巢四部分組織，其中，頭-咽下神經節PBAN基因表達量最高，腹神經索、性腺和卵巢次之。Li等將沙棘木蠹蛾末齡幼蟲分為頭-咽下神經節、馬氏管、脂肪體和腹神經索四部分分析PBAN的表達量，其中，頭-咽下神經節表達量最高，腹神經索次之，非神經組織表達量最低。Chang等將3日齡的雌性和雄性成蟲分別分為頭胸組織和腹部組織兩部分分析PBAN的表達差異，結果表明雌性和雄性成蟲的頭胸組織表達量較高，而腹部組織無表達或因表達量低而未被檢出。

關于芒果橫線尾夜蛾PBAN基因克隆及表達的研究國內外未見報道，因此采用實時熒光定量PCR研究芒果橫線尾夜蛾PBAN基因在不同組織的表達譜，為研究芒果橫線尾夜蛾性引誘劑的開發，利用芒果橫線尾夜蛾性信息素來干擾成蟲交配，用于芒果橫線尾夜蛾的監測和防治等綠色環境友好型防治芒果橫線尾夜蛾的新方法和新技術，并明確該PBAN基因在芒果橫線尾夜蛾性信息素的合成與釋放調控的功能提供依據。

發明內容

本發明的目的之一是為全面了解芒果橫線尾夜蛾PBAN基因的表達特性而設計的不同組織部位。

本發明的另一目的是提供一種高效快捷檢測芒果橫線尾夜蛾PBAN基因表達量的實時熒光定量PCR方法。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

芒果橫線尾夜蛾幼蟲或成蟲采集于福建省福清市，于福建省植物保護研究所飼養室用嫩葉、嫩梢飼養。化蛹后用指形管單只分裝，蛹和成蟲飼養溫度(25±1.0)℃?，相對濕度60％~70％?，光周期16?L：8D。收集羽化后24?h的芒果橫線尾夜蛾雌蟲3只，用刀片將頭、胸、腹切割分離，用液氮研磨后，采用E.Z.N.A?total?RNA?kit試劑盒進行總RNA?提取，共3次重復。

設計一對檢測芒果橫線尾夜蛾PBAN基因表達特性的引物，其特征包括符合熒光定量PCR反應特點的上下游引物：

PBAN-F：5’-CGACTTGGCAGAACTATGAACTTTT?-3’

PBAN-R：5’-TCGTGCTCCTCACTACTCTCACTT-3’

以及作為內參基因的上下游引物：

Tubulin-F:??5`-TTGATGAGGTCCGCACTGGC-3`

Tubulin-R:?5`-GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG-3`

本發明所述檢測芒果橫線尾夜蛾PBAN基因表達特性的熒光定量PCR法，其特征按如下步驟進行：

（1）cDNA第一鏈合成：提取樣本的總RNA并純化，采用反轉錄試劑盒得到以提取的RNA為模板反轉錄得到的cDNA；

（2）對下述引物進行常規PCR檢測