[發(fā)明專利]一種檢測芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量PCR法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410399669.2
• 申請日: 2014-08-15
• 公開（公告）號: CN104152559A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏輝;鄭麗禎;田厚軍;陳藝欣;林碩;常虹
• 申請（專利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種檢測芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量PCR法的特異性引物，其特征包括符合熒光定量PCR反應(yīng)特點(diǎn)的上下游引物：

PBAN-F：5'-CGACTTGGCAGAACTATGAACTTTT?-3'；

PBAN-R：5'-TCGTGCTCCTCACTACTCTCACTT-3’；

以及作為內(nèi)參基因的上下游引物：

Tubulin-F:?5`-TTGATGAGGTCCGCACTGGC-3`；

Tubulin-R:?5`-GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG-3`。

2.一種檢測芒果橫線尾夜蛾P(guān)BAN基因表達(dá)特性的熒光定量PCR法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）芒果橫線尾夜蛾處理試驗(yàn)：收集羽化后24?h的芒果橫線尾夜蛾雌蟲3只，用刀片將頭、胸、腹切割分離，用液氮研磨后，采用E.Z.N.A?total?RNA?kit試劑盒進(jìn)行總RNA?提取，共3次重復(fù)；

（2）cDNA第一鏈合成：提取樣本的總RNA并純化，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到以提取的RNA為模板反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA；

（3）對下述引物進(jìn)行常規(guī)PCR檢測

該基因的熒光定量上下游引物：

PBAN-F：5’-CGACTTGGCAGAACTATGAACTTTT?-3’；

PBAN-R：5’-TCGTGCTCCTCACTACTCTCACTT-3’；

以及作為內(nèi)參基因的上下游引物：

Tubulin-F:?5`-TTGATGAGGTCCGCACTGGC-3`；

Tubulin-R:?5`-GATTTCCTTGCCGATGGTGTAG-3`；

常規(guī)PCR擴(kuò)增體系如下：

常規(guī)PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5?min，然后94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，在此條件下進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10min；

（3）實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：

??以步驟（2）得到的cDNA為模板，加入步驟（3）所述的引物，進(jìn)行熒光定量PCR程序反應(yīng)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增后取平均值;

????實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系如下：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3?min，然后95℃變性10sec，60℃退火30sec，在此條件下進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。