[發明專利]一種可視化鑒定美洲大蠊的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201410396082.6
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104651486A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 胡佳;岳巧云;邱德義;陳健;吳可量;劉德星;魏曉雅
• 申請（專利權）人: 岳巧云
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種可視化鑒定美洲大蠊的方法及試劑盒。

背景技術

可視化檢測是近幾年新興的一種利用具有酶催化活性的DNA序列進行物種鑒定的技術。該技術在DNA測序、序列分析的技術上改進而來的檢測鑒定方法。利用DNA條形碼自身物種的保守性和不同物種之間的特異性，尋找物種之間特異的片段，設計特異性探針。該技術免去了測序的步驟，無需進行序列分析比對，更無需昂貴的熒光PCR儀，不需凝膠分析，僅需要普通的PCR儀，用肉眼即可檢測。

DNA條形碼技術是利用生物本身普遍具有的一段保守性適中、容易獲得的基因片段作為標準，建立在現代先進的DNA擴增、測序和比對技術基礎之上的一種物種鑒定手段。與傳統的形態鑒定相比，利用DNA條形碼進行物種鑒定具有以下優勢：對物種的鑒定將不再受物種發育狀態的限制，克服了卵、幼蟲、蛹等無法直接鑒定的缺點；對鑒定者的經驗和專業背景知識大大降低，減少主觀判斷的干擾；物種的鑒定更加準確快速。

美洲大蠊是一種常見的醫學媒介生物，攜帶大量的細菌、病毒、真菌和寄生蟲卵，經常出沒在廚房等家居環境，嚴重威脅著人民的生命健康，而其卵和若蟲無法根據形態進行直接鑒定，往往需要利用熒光PCR儀(儀器昂貴、耗材昂貴)、普通PCR儀(需凝膠檢測，接觸對人體有害的核酸染料)進行特異性檢測或者利用DNA條形碼技術(需凝膠檢測和耗時的測序)進行鑒定。急需一種簡便、快捷、直觀的鑒定方式。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種可視化鑒定美洲大蠊的方法。

本發明的另一目的在于提供實現可視化鑒定美洲大蠊的方法的試劑盒。

本發明的目的通過下述技術方案實現：一種可視化鑒定美洲大蠊的方法，包括如下步驟：

(1)設計美洲大蠊的可視化探針序列，如下：

探針I(5’-3’)：

AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA

其中，方框框住部分為前綴序列；與劃橫線部分序列反向互補，起到沉默空白的作用；粗體字部分為G-四聯結構；

(2)模板DNA的提取：提取待檢標本的基因組DNA；

(3)COI序列的制備：以步驟(2)得到的基因組DNA為模板，以LCO1490和HCO2198為引物對進行PCR反應，再將PCR產物純化，得到COI序列；

LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；

(4)可視化擴增：以步驟(3)得到的COI序列為模板，以LCO1490和探針I為引物對進行PCR反應；

(5)顯色和結果判斷：向步驟(4)得到的可視化擴增產物中加入NaCl溶液，變性和復性；接著加入氯鐵血紅素(hemin)反應，再加入H₂O₂和ABTS^2-，觀察顏色變化；顏色變為綠色，表示待檢樣品為美洲大蠊；顏色沒有發生變化，表示待檢樣品非美洲大蠊；

步驟(2)中所述的待檢標本的基因組DNA的提取可通過常規方法或試劑盒提取；

步驟(3)中所述PCR反應的體系優選為：10×PCR?buffer5μl，dNTP(2.5mM?each)2μl，EX?Taq酶(5U/μl)0.5μl，LCO1490(20μM)和HCO2198(20μM)各1μl，基因組DNA3μl，ddH₂O補足至50μl；

步驟(3)中所述PCR反應的條件優選為：94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃30s，20個循環；72℃10min；

步驟(3)中所述的將PCR產物純化可通過如下步驟實現：將PCR產物進行凝膠電泳，切下含目的基因條帶的凝膠，提取目的基因；

所述的凝膠為瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠；

所述的提取可通過常規方法提取或通過試劑盒提取；如瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒；

步驟(4)中所述可視化擴增的體系優選為10×PCR?buffer5μl，dNTP(2.5mM?each)2μl，DNA?Polymerase?I酶(5U/μl)0.5μl，LCO1490(20μM)1μl，探針I(20μM)4μl，COI序列1μl，ddH₂O補足至50μl；