[發明專利]一種可視化鑒定美洲大蠊的方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201410396082.6
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104651486A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 胡佳;岳巧云;邱德義;陳健;吳可量;劉德星;魏曉雅
• 申請（專利權）人: 岳巧云
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)設計美洲大蠊的可視化探針序列，如下：

探針I，方向為5’-3’：

AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA

其中，方框框住部分為前綴序列；與劃橫線部分序列反向互補，起到沉默空白的作用；粗體字部分為G-四聯結構；

(2)模板DNA的提取：提取待檢標本的基因組DNA；

(3)COI序列的制備：以步驟(2)得到的基因組DNA為模板，以LCO1490和HCO2198為引物對進行PCR反應，再將PCR產物純化，得到COI序列；

LCO1490：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’；

HCO2198：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’；

(4)可視化擴增：以步驟(3)得到的COI序列為模板，以LCO1490和探針I為引物對進行PCR反應；

(5)顯色和結果判斷：向步驟(4)得到的可視化擴增產物中加入NaCl溶液，變性和復性；接著加入氯鐵血紅素反應，再加入H₂O₂和ABTS^2-，觀察顏色變化；顏色變為綠色，表示待檢樣品為美洲大蠊；顏色沒有發生變化，表示待檢樣品非美洲大蠊。

2.根據權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟(3)中所述PCR反應的體系為：10×PCR?buffer5μl，每種脫氧核苷酸濃度為2.5mM的dNTP2μl，濃度為5U/μl的EX?Taq酶0.5μl，20μM的LCO14901μl、20μM的HCO21981μl，基因組DNA3μl，ddH₂O補足至50μl；

步驟(3)中所述的PCR反應的條件為：94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃30s，20個循環；72℃10min。

3.根據權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟(3)中所述的將PCR產物純化通過如下步驟實現：將PCR產物進行凝膠電泳，切下含目的基因條帶的凝膠，提取目的基因。

4.根據權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟(4)中所述可視化擴增的體系為10×PCR?buffer5μl，每種脫氧核苷酸濃度為2.5mM的dNTP2μl，濃度為5U/μl的DNA?Polymerase?I酶0.5μl，20μM的LCO14901μl，20μM的探針I4μl，COI序列1μl，ddH₂O補足至50μl；

步驟(4)中所述可視化擴增的條件為94℃3min；94℃30s、50℃30s、72℃45s，30個循環。

5.根據權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟(5)中所述的空白沉默液為濃度為1.714M的NaCl溶液。

6.根據權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟(5)中所述的變性的條件為：95℃保溫5min；

步驟(5)中所述的復性的條件為：變性后以1℃/min的速度降溫至25℃保溫30min；

步驟(5)中所述的反應的條件為25℃保溫60min；

步驟(5)中所述的觀察顏色變化的觀察時間為2min。

7.根據權利要求1所述的可視化鑒定美洲大蠊的方法，其特征在于：步驟(5)中各成分的用量如下：每50μl可視化擴增產物加入0.012mol?NaCl、0.108μmol?hemin、0.126mmol?H₂O₂和0.126mmol?ABTS^2-。

8.一種實現上述可視化鑒定美洲大蠊的方法的試劑盒，其特征在于：包含探針I；探針I的序列如下：

5’-AACTTTATTACTAGCTAGTAGTATAGTAGAAAGAGGTGCCGGA-3’；

其中，方框框住部分為前綴序列；與劃橫線部分序列反向互補，起到沉默空白的作用；粗體字部分為G-四聯結構。