[發明專利]轉基因玉米98140結構特異定量PCR精準檢測的引物和探針及方法

有效

• 申請號: 201410394511.6
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104131106A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 張富麗;宋君;尹全;常麗娟;劉文娟;王東;雷紹榮
• 申請（專利權）人: 四川省農業科學院分析測試中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 成都頂峰專利事務所(普通合伙) 51224
• 代理人: 楊俊華

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及基因的定量的分析方法。

背景技術

國際上很多國家對轉基因產品實施限量標識和進口，而我國尚無具體的轉基因產品標識閾值。為了打破歐盟等國家和地區設置的轉基因產品貿易技術壁壘，同時彌補和完善我國轉基因生物及產品定量檢測技術體系，更好地保護消費者對轉基因產品的知情權和選擇權，建立一種新型轉基因玉米98140結構特異定量PCR精準檢測方法已成為必要。

目前關于轉基因玉米98140的檢測技術，主要集中在普通定性PCR分析方法和標準，尚無關于檢測轉基因玉米98140及產品的結構特異性某特定位點（基因序列）的定量PCR精準檢測技術。

發明內容

本發明的目的主要是提供一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米98140及產品的結構特異性某特定位點的定量PCR精準檢測技術。

本發明通過下述技術方案實現：

轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測的引物和探針：?

上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'；

下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'；

熒光探針序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'。實現對pinⅡ終止子與zm-hra?gene相連位置核酸片段的檢測。

轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測的引物和探針：

上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'；

下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'；

熒光探針序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'。實現對Gate4621gene與pinⅡ終止子相接處核酸片段的檢測。

上述轉基因玉米98140結構特異性定量PCR精準檢測方法，包括以下步驟：當檢測pinⅡ終止子與zm-hra?gene相連位置核酸片段時，具體步驟如下：

（a1）合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'

下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'

熒光探針序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'；

（a2）制備98140品系的DNA稀釋液；

（a3）配制PCR反應體系；

（a4）定量PCR檢測。

當檢測Gate4621gene與pinⅡ終止子相接處核酸片段時，具體步驟如下：

（b1）合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'

下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'

熒光探針序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'；

（b2）制備98140品系的DNA稀釋液；

（b3）配制PCR反應體系；

（b4）定量PCR檢測。

進一步地，步驟（a1）和（b1）中合成的引物及熒光探針的濃度均為10μmol/l，步驟（a2）和（b2）中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/μl。

再進一步地，步驟（a3）和（b3）中所述的配制PCR反應體系，即將DNA稀釋液加入到20μl反應體系中，所述20μl的反應體系包括以下組分：

Taqman?Master?mix（2×）?????????????????10μl

上游引物?????????????????????????????????1μl

下游引物?????????????????????????????????1μl

熒光探針?????????????????????????????????0.5μl

DNA稀釋液???????????????????????????????3.0μl