[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測的引物和探針及方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410394511.6
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104131106A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張富麗;宋君;尹全;常麗娟;劉文娟;王東;雷紹榮
• 申請（專利權(quán)）人: 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 成都頂峰專利事務(wù)所(普通合伙) 51224
• 代理人: 楊俊華

1.轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測的引物和探針，其特征在于,

用于檢測pinⅡ終止子與zm-hra?gene相連位置的引物和探針如下：

上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'；

下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'；

熒光探針序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'；

用于檢測Gate4621gene與pinⅡ終止子相接處的引物和探針如下：

上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'；

下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'；

熒光探針序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'。

2.?轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于,包括以下步驟：檢測pinⅡ終止子與zm-hra?gene相連位置：

（a1）合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'

下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'

熒光探針序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'；

（a2）制備98140品系的DNA稀釋液；

（a3）配制PCR反應(yīng)體系；

（a4）定量PCR檢測。

3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于，檢測Gate4621gene與pinⅡ終止子相接處：

（b1）合成以下引物及與引物配合使用的熒光探針，

上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'

下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'

熒光探針序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'；

（b2）制備98140品系的DNA稀釋液；

（b3）配制PCR反應(yīng)體系；

（b4）定量PCR檢測。

4.?根據(jù)權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于，步驟（a1）和（b1）中合成的引物及熒光探針的濃度均為10μmol/l，步驟（a2）和（b2）中制備的DNA稀釋液的濃度為50ng/μl。

5.?根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于，步驟（a3）和（b3）中所述的配制PCR反應(yīng)體系，即將DNA稀釋液加入到20μl反應(yīng)體系中，所述20μl的反應(yīng)體系包括以下組分：

Taqman?Master?mix（2×）?????????????????10μl

上游引物?????????????????????????????????1μl

下游引物?????????????????????????????????1μl

熒光探針?????????????????????????????????0.5μl

DNA稀釋液???????????????????????????????3.0μl

50?ROX???????????????????????????????????0.4μl

水???????????????????????????????????????4.1μl。

6.?根據(jù)權(quán)利要求3或5所述的轉(zhuǎn)基因玉米98140結(jié)構(gòu)特異性定量PCR精準(zhǔn)檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min，1個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，57℃退火60s，45個(gè)循環(huán)。