[發明專利]羊痘病毒屬病毒Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201410394083.7
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104152584B
• 公開（公告）日: 2016-11-02
• 發明（設計）人: 聶福平;王昱;楊俊;李應國;王國民;韓雪清;李賢良;王慧煜
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術領域

本發明涉及動物病毒分子生物學檢驗方法領域，具體涉及一種羊痘病毒屬病毒Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、方法和試劑盒。

背景技術

羊痘病毒屬病毒（Capripoxvirus,CPV）包括山羊痘病毒（Goatpox?Virus,GTPV）、綿羊痘病毒（Sheeppox?Virus,SPPV）和牛疙瘩皮膚病病毒（Lumpy?Skin?Disease?Virus,LSDV）三種，能引起山羊、綿羊和牛的皮膚、器官表面廣泛性結節和水腫，病畜產乳量急劇減少，皮毛品質極大下降，造成巨大經濟損失。山羊痘、綿羊痘病毒引起的羊痘又名羊“天花”，是羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。綿羊痘和山羊痘，被我國列為一類傳染病，對畜牧業養殖影響重大。根據不同毒株的毒力差異，易感羊群的致死率可達10%～58%或?75%～100%不等。羔羊致死率可達?100%，妊娠母羊極易流產。同時，因自由貿易受到限制造成了國家稅收的下降，致使此病也成為了重要的經濟疾病。該病呈世界性分布，我國近年來在如廣西、貴州、黑龍江、甘肅等地也有發生。牛疙瘩皮膚病病毒引起牛的疙瘩皮膚病，又稱牛結節性皮炎或牛結節疹、塊狀皮膚病，是以患牛發熱、皮膚、黏膜、器官表面廣泛性結節，淋巴結腫大，皮膚水腫為特征的傳染病，能引起感染動物消瘦，產乳量大幅度降低，嚴重時導致死亡。被世界動物衛生組織（OIE）列為必須通報的動物疫病，感染率為5%～85%，病死率為10%；我國目前尚無牛疙瘩皮膚病病毒流行的報導，國內也無檢測該病的相關研究，由于印度和斯堪的納維亞都有人類感染羊痘病毒的報道，因此，本病在公共衛生方面具有一定的意義。在印度，管理患病動物的人有的手和腿上發生紅色丘疹，繼而出現水皰并結痂，但未見有全身性的擴散。張瑞陽等（2003）首次報道了我國人感染羊痘的病例，病人手指、口唇、面頰等部位出現丘疹。攜帶有病毒的牛羊肉存在使人患病的可能性，對于肉制食品的安全存在潛在的隱患，因此，本發明的試劑盒和檢測方法在動物產品及其食品的出入境的快速檢驗檢疫中具有重大的意義。

羊痘病毒（Capripoxvirus,CPV）在分類上屬于痘病毒科（poxviridae）脊椎動物痘病毒亞科（chordopoxrinae）中的羊痘病毒屬（Capripoxvirus）。羊痘病毒為磚形病毒，在細胞漿內復制，其基因組為雙鏈?DNA。其大小約為?290nm×270nm，屬于較小的痘病毒，病毒粒子由1?個核心、2個側體和2?層脂質外膜組成，羊痘病毒的衣殼為對稱型，有囊膜，囊膜內含有病毒特異性蛋白。?該病毒對干燥有較強的抵抗力，在干燥的痂皮內可存活?3-6?個月，在干燥羊舍內可存活?6-8個月。反復凍融對其沒有明顯的滅活作用。對直射陽光、常用消毒藥（酒精、碘酒等）以及乙醚或氯仿較敏感。放線菌素-D和溴脂氧尿苷可抑制病毒復制。?

山羊痘、綿羊痘和牛疙瘩皮膚病病毒很強的宿主特異性，自然條件下，不會發生交叉感染。但病毒對上皮細胞有特殊親和力，因此無論通過哪種途徑進入機體的病毒，最終都經血液達到皮膚和粘膜，在上皮細胞內增殖，引起一系列的炎癥過程而發生特異性的痘疹。山羊和綿羊均為易感動物。本病多有病羊和含有羊痘病毒的皮屑隨風和灰塵吸入呼吸道而感染，也可以通過損傷的皮膚及消化道傳染。丘疹中含大量病毒，黏膜上的丘疹破潰后可從鼻、口分泌物和淚液排泄病毒。病毒進入乳汁、尿液和精液也可成為病毒傳播的重要來源。被病羊污染的用具、飼料、墊草，病羊的糞便、分泌物、皮毛和體外寄生蟲（如羊虱）都可以成為傳播媒介。該病以春秋兩季多發，主要在冬季春初流行，常呈地方性或廣泛流行。氣候嚴寒、雨雪、霜凍、枯草和飼養管理不良等因素都有助于本病的發生和加重病情。目前控制該病最有效的方法還是使用高效疫苗對易感動物進行免疫接種。本發明的試劑盒和檢測方法在排查上述飼養用具、飼料、墊草，病羊的糞便、分泌物等是否含有羊痘病毒屬病毒也具有重要意義。

?TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團鏈接在探針的5^，末端，淬滅基團則在3^，端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3^，端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5^，外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發射熒光。一分子的產物生成就會伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷的積累。因此TaqMan探針檢測的是積累熒光。目前，水解探針已被用于基因檢測、病毒定量、癌細胞基因微突變檢測、細胞因子基因定量等，其結果都具有高特異性與高敏感性。