[發明專利]羊痘病毒屬病毒Taqman-MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物、方法和試劑盒

有效

• 申請號: 201410394083.7
• 申請日: 2014-08-12
• 公開（公告）號: CN104152584B
• 公開（公告）日: 2016-11-02
• 發明（設計）人: 聶福平;王昱;楊俊;李應國;王國民;韓雪清;李賢良;王慧煜
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

1.羊痘病毒屬病毒Taqman—MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用引物及探針，其特征在于：包括羊痘病毒屬病毒通用上游引物，其NDA序列為SEQ?ID?NO.1;

羊痘病毒屬病毒通用下游引物，其NDA序列為SEQ?ID?NO.2；

牛疙瘩皮膚病病毒MGB探針，其NDA序列為SEQ?ID?NO.3；

山羊痘病毒MGB探針，其NDA序列為SEQ?ID?NO.4；

綿羊痘病毒MGB探針，其NDA序列為SEQ?ID?NO.5。

2.羊痘病毒屬病毒Taqman—MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于，包括擴增反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中：

所述擴增反應液管，管內由以下反應液組成：

DNA序列為SEQ?ID?NO.1的10μmol/L的羊痘病毒屬病毒通用上游引物1.6μL；

DNA序列為SEQ?ID?NO.2的10μmol/L的羊痘病毒屬病毒通用下游引物1.6μL；

DNA序列為SEQ?ID?NO.3的10μmol/L的牛疙瘩皮膚病病毒MGB探針0.6μL；

DNA序列為SEQ?ID?NO.4的10μmol/L的山羊痘病毒MGB探針0.3μL；

DNA序列為SEQ?ID?NO.5的10μmol/L的綿羊痘病毒MGB探針3.0?μL；

2×Premix?Ex?Taq緩沖液?8?μL；

滅菌去離子水?1.9?μL；

合計17μL，為單次反應的用量；

所述陽性對照管，管內為牛疙瘩皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒三種羊痘病毒屬病毒陽性重組質粒的混合DNA，體積為20μL；

所述陰性對照管，管內為無牛疙瘩皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒三種羊痘病毒屬病毒感染的上皮組織基因組DNA，體積為20μL；

所述滅菌去離子水管?1mL～2mL。

3.根據權利要求2所述羊痘病毒屬病毒Taqman—MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測用試劑盒，其特征在于：所述DNA序列為SEQ?ID?NO.3的牛疙瘩皮膚病病毒MGB探針的5^，端標記有VIC報告基團，3^，端標記有非淬滅基團；DNA序列為SEQ?ID?NO.4的山羊痘病毒MGB探針的5^，端標記有FAM報告基團，3^，端標記有非淬滅基團；DNA序列為SEQ?ID?NO.5的綿羊痘病毒MGB探針的5^，端標記有NED報告基團，3^，端標記有非淬滅基團。

4.利用權利要求2所述試劑盒進行羊痘病毒屬病毒Taqman—MGB探針多重實時熒光定量PCR檢測的非疾病診斷目的的檢測方法，包括如下步驟：

1）制備待檢模板DNA：選用市售化的細胞培養液DNA提取試劑盒，提取待檢樣品的基因組DNA，獲得待檢模板DNA；

2）擴增反應體系為：17μL擴增反應液；3μL待檢模板DNA或陽性對照或陰性對照；反應體系的總體積為20μL;

3）羊痘病毒屬病毒熒光定量PCR擴增：將步驟2）中配制好的擴增反應體系進行PCR擴增，反應條件：預變性95℃?30s；95℃?5s，60℃?34s?40個循環；在60℃?34s進行熒光信號的采集；

4）結果判定：將擴增反應在35個循環以內且擴增曲線良好的反應直接判定為陽性，35個循環以后的可直接判定為陰性，同時陽性對照的擴增明顯，陰性對照沒有擴增。