[發(fā)明專利]一種用于擴增子測序的建庫方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410391037.1
• 申請日: 2014-08-11
• 公開（公告）號: CN104153004A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設計）人: 林芹;于丹;李勝彬;陳華;陶曄;曾亮
• 申請（專利權）人: 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 上海晨皓知識產權代理事務所(普通合伙) 31260
• 代理人: 成麗杰

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，特別涉及一種用于擴增子測序的快速建庫方法。

背景技術

隨著高通量測序技術的發(fā)展，測序成本的降低，使測序技術逐漸成為基礎生物學研究和醫(yī)學檢測的常規(guī)實驗方法。從人類基因組計劃構建了第一個基因組圖譜開始，新一代測序技術通過全基因組測序構建了大量常規(guī)物種的基因組圖譜，也促進了測序技術的高速發(fā)展。但全基因組測序結構復雜，數(shù)據(jù)量大，周期長，費用高，限制了它的發(fā)展。

同時，有的研究者只對特定的基因組區(qū)域感興趣，這時就只需對相應區(qū)域進行測序研究，不需要對全基因組進行測序。擴增子測序(Amplicon?Sequencing)就是只對目標區(qū)域進行測序研究的一項測序方法。通過設計感興趣的基因組區(qū)域的引物，進行PCR擴增，對目標區(qū)域進行富集，然后針對特定長度的PCR產物或者捕獲的片段進行建庫，高通量測序，分析序列中的變異。擴增子測序能根據(jù)研究者目的，針對目標區(qū)域進行高覆蓋度的測序，還可以檢測到低頻突變。采用擴增子測序，研究者可以對基因組中感興趣的關鍵區(qū)域進行重點研究。這種高針對性的方法可以高效的發(fā)現(xiàn)，驗證和篩選關注區(qū)域的基因組變異。相比全基因組測序，擴增子測序對目標區(qū)域有更準確快速的研究，適用于大量樣本的特定基因組區(qū)域研究。

目前的擴增子測序都是通過常規(guī)的建庫方法，在通過PCR擴增富集到目標區(qū)域后，進行混樣，然后進行末端修復和加A，再加接頭，純化樣品，跑膠回收目的條帶，然后PCR擴增，最后再跑膠回收主帶，該種常規(guī)的建庫方法步驟繁瑣，浪費時間，工作量大，不利于大量樣品的測序建庫。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種適用于擴增子測序的快速建庫方法，以簡化擴增子測序中建庫步驟的操作過程，降低擴增子測序建庫的時間和成本，同時保證不影響測序質量。

本發(fā)明所提供的用于擴增子測序的建庫方法包括以下步驟：

(1)PCR擴增富集目標區(qū)域：對待測樣品基因組DNA，針對目標區(qū)域設計引物序列，該引物序列在正向引物和反向引物的5’端設有隨機堿基序列和接頭序列，進行PCR擴增，回收PCR產物；

(2)PCR擴增引入測序接頭：將步驟(1)所得到的PCR產物進行混樣，設計引物序列，該引物序列包含與步驟(1)中的接頭序列互補的序列，對混樣進行PCR擴增，回收PCR產物，即得到用于擴增子測序的DNA文庫。

本發(fā)明的用于擴增子測序的建庫方法，在步驟(1)之前還包括提取待測樣品基因組DNA的步驟，該提取步驟可采用本領域內常規(guī)方法進行，例如使用Omega公司的SOIL?DNA?KIT進行提取；此外，在步驟(2)之后還包括測序并對測序數(shù)據(jù)進行生物信息學分析的步驟，本發(fā)明建庫后的上機測序可以通過一代測序平臺進行，也可通過高通量測序平臺進行，例如ABI公司的3730XL測序平臺或Illumina公司的miseq測序平臺等。進行生物信息學分析的步驟主要是指通過質控和barcode得到優(yōu)化數(shù)據(jù)，然后聚OTU，物種注釋，α多樣性分析(稀釋曲線、shannon曲線、物種累積曲線；chao、simpson等多樣性指數(shù))，β多樣性分析(pca、pcoa聚類；系統(tǒng)進化樹，物種分布、顯著性差異、環(huán)境因子梯度分析、各種分組比較等)。

本發(fā)明所提供的用于擴增子測序的建庫方法的流程圖如附圖1所示。

具體來說，本發(fā)明的步驟(1)進行了第一次PCR擴增，以完成富集目標區(qū)域的操作。在針對測序目標區(qū)域進行引物設計時：引物總長度≤59bp，退火溫度55℃～75℃。在正向引物和反向引物的5’端設有隨機堿基序列和接頭序列，其中隨機堿基的個數(shù)可設計為1～10個，在本發(fā)明的具體實施方式部分采用的是1～5個隨機堿基的方案。接頭序列是與測序儀相配套的序列，例如illumina的”Y”字型的序列。隨機堿基序列和接頭序列的設計主要達到以下三個方面的目的：(1)引入?yún)^(qū)分樣本標簽；(2)引入去除嵌合體序列標簽；(3)引入測序接頭，方便測序。最后，回收PCR產物時可采用凝膠電泳法切膠回收目的條帶。