[發(fā)明專利]磁珠法提取細(xì)菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410388366.0
• 申請(qǐng)日: 2014-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104212793B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郝榮章;宋宏彬;李楊;趙榮濤;許金坤;盧曉;董世彪;邱少富;王勇;賈雷立;李鵬;謝靖;王立貴;吳志豪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制所
• 主分類號(hào): C12N15/10
• 分類號(hào): C12N15/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司33200
• 代理人: 邱啟旺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種磁珠法提取細(xì)菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法。

背景技術(shù)

在分子生物學(xué)技術(shù)中，無(wú)論是建立基因文庫(kù)、酶切、分子克隆還是全基因組關(guān)聯(lián)分析，都需要從樣本中提取DNA模板。所提取的DNA濃度、純度以及一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性直接影響到后續(xù)研究，因此DNA的質(zhì)量好壞是基因研究成敗的首要因素。

在傳統(tǒng)DNA提取方法中，離心柱法和酚-氯仿法是最主要的兩種方法，其提取的DNA雖質(zhì)量較高，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大，最重要的是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所使用的氯仿等有毒試劑對(duì)操作者和生態(tài)環(huán)境都造成很大的傷害，而采用磁珠為載體的分離技術(shù)，無(wú)需離心，無(wú)需接觸有毒試劑，且操作簡(jiǎn)單方便，很容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，短時(shí)間就能實(shí)現(xiàn)樣本DNA的快速、高質(zhì)量的提取，是未來(lái)高通量提取核酸發(fā)展的一個(gè)重要方向，具有傳統(tǒng)DNA提取方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。

目前，國(guó)外比較知名的生物技術(shù)公司，如Qiagen、Promega、Amresco等都相繼開(kāi)發(fā)出了磁珠法核酸提取試劑盒或磁珠法高通量核酸提取儀，他們的產(chǎn)品大都操作步驟簡(jiǎn)單、獲得的核酸質(zhì)量高，片段完整，但價(jià)格昂貴；國(guó)內(nèi)比較知名的生物技術(shù)公司，如天根、康為世紀(jì)、金麥格等開(kāi)發(fā)出的磁珠法核酸提取試劑盒，內(nèi)置磁珠均為多分散磁珠，雖然磁響應(yīng)速度很快，但磁珠沉降速度也很快，由此導(dǎo)致磁珠與緩沖液作用不充分，這也成為制約其產(chǎn)品發(fā)展的一個(gè)主要因素。因此，在國(guó)內(nèi)開(kāi)發(fā)內(nèi)置磁珠為單分散磁珠并配合相應(yīng)的緩沖液系統(tǒng)，使獲得的DNA片段大、純度高、質(zhì)量穩(wěn)定可靠，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求的磁珠法核酸提取產(chǎn)品已迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種采用磁珠法提取細(xì)菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種磁珠法提取細(xì)菌基因組DNA的試劑盒，包括緩沖液A、緩沖液B、緩沖液C、磁珠懸浮液D、緩沖液E、緩沖液F、緩沖液G七種組分；

所述緩沖液A終濃度組成為：20-50mmol/L葡萄糖、10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、5-20mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），溶劑為高壓滅菌水 (緩沖液A終PH=8.0-8.5)；

所述緩沖液B終濃度組成為：15-25mg/ml蛋白酶K、1-5mol/L鹽酸胍、5-25mmol/L檸檬酸鈉、1-2%曲拉通（Triton X-100）、0.5-5mmol/L EDTA，溶劑為高壓滅菌水 (緩沖液B終PH=4.0-5.5)；

所述緩沖液C成分組成為：無(wú)水乙醇溶液；

所述緩沖液E終濃度組成為：1-5mol/L醋酸鈉，體積分?jǐn)?shù)為20-40%無(wú)水乙醇，溶劑為高壓滅菌水 (緩沖液E終PH=4.0-5.5)；

所述緩沖液F終濃度組成為：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L 0.5-5mmol/L EDTA、5-25mmol/L檸檬酸鈉和無(wú)水乙醇，0.3-0.7 L/L的無(wú)水乙醇，溶劑為高壓滅菌水 (緩沖液F終PH=8.0-8.5)；

所述緩沖液G終濃度組成為：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L EDTA，溶劑為高壓滅菌水 (緩沖液G終PH=8.0-8.5)。

所述磁珠懸浮液D成分組成為：每200mmol/L氯化鈉水溶液中含有50mg單分散Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS納米磁珠。單分散Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS納米磁珠通過(guò)以下步驟制備得到：

（1）溶劑熱法制備單分散的四氧化三鐵納米球；

（2）采用改進(jìn)的St?ber法，在四氧化三鐵納米球外包覆二氧化硅，得到單分散的Fe₃O₄@SiO₂納米球，具體為：稱取0.1g步驟（1）制備得到的四氧化三鐵納米球，向其中依次加入20ml去離子水、80ml無(wú)水乙醇和1ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28%的氨水，超聲混合均勻后向混合液中加入1ml正硅酸乙酯，室溫（20°C）下機(jī)械攪拌6小時(shí)；反應(yīng)完畢后，將所得溶液離心，并依次用去離子水和乙醇清洗3次，制得單分散的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球（Fe₃O₄@SiO₂納米球），將所得產(chǎn)物在60°C烘箱中干燥待用；