[發明專利]磁珠法提取細菌基因組DNA的試劑盒及其提取方法

有效

• 申請號: 201410388366.0
• 申請日: 2014-08-08
• 公開（公告）號: CN104212793B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發明（設計）人: 郝榮章;宋宏彬;李楊;趙榮濤;許金坤;盧曉;董世彪;邱少富;王勇;賈雷立;李鵬;謝靖;王立貴;吳志豪
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍疾病預防控制所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 邱啟旺

1.一種磁珠法提取細菌基因組DNA的試劑盒，其特征在于：其包括緩沖液A、緩沖液B、緩沖液C、磁珠懸浮液D、緩沖液E、緩沖液F、緩沖液G七種組分；

所述緩沖液A終濃度組成為：20-50mmol/L葡萄糖、10-30mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、5-20mmol/L乙二胺四乙酸，溶劑為高壓滅菌水，緩沖液A終PH=8.0-8.5；

所述緩沖液B終濃度組成為：15-25mg/ml蛋白酶K、1-5mol/L鹽酸胍、5-25mmol/L檸檬酸鈉、1-2%曲拉通、0.5-5mmol/L EDTA，溶劑為高壓滅菌水，緩沖液B終PH=4.0-5.5；

所述緩沖液C成分組成為：無水乙醇溶液；

所述緩沖液E終濃度組成為：1-5mol/L醋酸鈉，體積分數為20-40%無水乙醇，溶劑為高壓滅菌水，緩沖液E終PH=4.0-5.5；

所述緩沖液F終濃度組成為：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L EDTA、5-25mmol/L檸檬酸鈉和0.3-0.7 L/L的無水乙醇，溶劑為高壓滅菌水 ，緩沖液F終PH=8.0-8.5；

所述緩沖液G終濃度組成為：10-30mmol/L Tris-HCl、0.5-5mmol/L EDTA，溶劑為高壓滅菌水，緩沖液G終PH=8.0-8.5；

所述磁珠懸浮液D成分組成為：每200mmol/L氯化鈉水溶液中含有50mg單分散Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS納米磁珠；

所述單分散Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS納米磁珠通過以下步驟制備得到：

（1）溶劑熱法制備單分散的四氧化三鐵納米球；

（2）采用改進的St?ber法，在四氧化三鐵納米球外包覆二氧化硅，得到單分散的Fe₃O₄@SiO₂納米球，具體為：稱取0.1g步驟（1）制備得到的四氧化三鐵納米球，向其中依次加入20ml去離子水、80ml無水乙醇和1ml質量分數為28%的氨水，超聲混合均勻后向混合液中加入1ml正硅酸乙酯， 20°C下機械攪拌6小時；反應完畢后，將所得溶液離心，并依次用去離子水和乙醇清洗3次，制得單分散的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球，將所得產物在60°C烘箱中干燥待用；

（3）使用硅烷偶聯劑氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷對步驟（2）獲得的Fe3O₄@SiO₂進行硅烷化處理，得到Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS；具體為：稱取0.1g步驟（2）得到的Fe₃O₄@SiO₂納米球，加入到20ml二甲基甲酰胺中，超聲分散后得到溶液A；將10ml的氨乙基氨丙基聚二甲基硅氧烷和20ml的二甲基甲酰胺混合均勻后，加入一定量的丁二酸酐使得混合溶液pH值維持在3.9~4.1，60°C下機械攪拌3小時，得到溶液B；將溶液A、B混合后加入20ml去離子水，在60°C下繼續機械攪拌5小時后，將所得溶液離心，并依次用去離子水和乙醇清洗3次，制得單分散的硅烷化的二氧化硅包覆四氧化三鐵納米球Fe₃O₄@SiO₂-AEAPS。

2.一種權利要求1所述的試劑盒提取細菌基因組DNA的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）取待測細菌培養液1-1.5ml置于2.0ml EP管中，12000 rpm離心1-3min，收集菌體，加入150-300μl 緩沖液A；

（2）向步驟（1）EP管中加入150-300μl緩沖液B，45-65°C水浴孵育5-10min；

（3）向步驟（2）孵育后的EP管中加入150-300μl緩沖液C，混勻后靜置5-10min；

（4）向步驟（3）靜置后的EP管中加入10-50μl磁珠懸浮液D，將EP管置于磁力架上，靜置10-60s后去除液體；

（5）將步驟（4）EP管從磁力架上取下，加入200-600μl緩沖液E，混勻混勻后將EP管置于磁力架上，靜置10-60s后去除液體，再將EP管從磁力架上取下，加入200-1000μl緩沖液F，抽打混勻或振蕩混勻后將EP管置于磁力架上，靜置10-60s后去除液體，室溫靜置5-10min；

（6）將步驟（5）EP管從磁力架上取下，加入50-100μl緩沖液G，混勻后將EP管置于45-65°C水浴孵育5-10min，取出后將EP管置于磁力架上靜置10-60s后將上清液轉移至收集管中，完成細菌DNA的提取。