[發明專利]一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法

在審

• 申請號: 201410387843.1
• 申請日: 2014-08-07
• 公開（公告）號: CN104164415A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 錢衛東;周穎欣;王婷;寧肖肖;蔡長龍;毛培宏
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12R1/645
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

技術領域

本發明屬于離子束技術領域，具體涉及一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法。

背景技術

D-阿拉伯糖醇是一種五碳糖醇，分子式為C₅H₁₂O₅，分子量為152.12，是木糖醇和核糖醇的同分異構體。糖醇是經糖還原的一類多元醇，具有低熱值、抗齲齒、不影響胰島素水平等優點，在醫藥、食品、化工等領域具有重要的應用價值。目前，常規生產D-阿拉伯糖醇的方法主要是化學法合成，但是該方法反應過程復雜、設備要求高、環境污染嚴重。針對化學合成法的缺點，人們將目光集中于通過生物轉化法生產D-阿拉伯糖醇，其反應條件溫和、生產工藝簡單，因而備受關注。

Spencer等人研究發現耐高滲酵母在高滲條件下可產生多元醇，代謝葡萄糖產生的多元醇主要有甘油、D-阿拉伯糖醇、赤醉糖醇等，其中五碳多元醇以D-阿拉伯糖醇為主，截止目前可用于生產D-阿拉伯糖醇的菌株，主要包括曲霉菌屬(Aspergillus)、假絲酵母屬(Candida)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)、擬內袍霉屬(EndomycoPsis)、小叢梗袍屬(Moniliella)、漢遜酵母屬(Hansenula)、畢赤母屬(Pichia)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)。但是，大部分產D-阿拉伯糖醇的酵母菌株對底物葡萄糖的轉化率較低，多數酵母菌株的轉化葡萄糖產D-阿拉伯糖醇的底物葡萄糖的轉化率介于10％～40％之間，并且普遍存在甘油及其他多元醇副產物。乳酸克魯維酵母是一種能夠以乳酸作為其唯一的碳源和能源的酵母，具有營養要求簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫度適應范圍廣(25～46℃)、分泌蛋白能力強、不產生內毒素、對人類安全等優點，因此長期以來一直被用于發酵工業。

低能離子N⁺注入技術作為一種新的誘變源,目前在國內微生物育種中取得顯著成效,其原因在于低能離子注入生物體時同時存在能量交換、能量沉積、質量沉積及電荷交換四大效應。由于注入離子的電荷數、質量數、能量和劑量的組合不同，可以提供眾多的誘變條件，使離子注入誘變具有突變譜寬，突變率高的特點，從而可以篩選到符合生產要求、提高產量的突變體。然而低能N⁺離子注入技術轉化的隨機性較大，建立一種高通量的快速篩選方法尤為重要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法。

為達到上述目的，本發明采用了以下技術方案：

1)初篩：將經過誘變的出發酵母菌株接種于YPD液體培養基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振蕩培養24～28h得預培養液，將預培養液涂布于高糖固體培養基上，然后于28～37℃恒溫培養48～60h，所述高糖固體培養基含有500～550g/L的葡萄糖；

2)復篩：經過恒溫培養后，挑取生長于高糖固體培養基上的單菌落并接種于YPD液體培養基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振蕩培養24～28h得種子培養液，將種子培養液接種于YPD發酵培養基中，然后于160～200r/min、28～37℃下振蕩培養96～144h得發酵液，將發酵液離心，將離心得到的上清液用紙色譜法進行分析，根據紙色譜上D-阿拉伯糖醇對應的顯色斑點篩選D-阿拉伯糖醇產量較高的突變菌株。

利用低能離子注入技術對出發酵母菌株進行誘變。

所述出發酵母菌株為乳酸克魯維酵母。

所述誘變具體包括以下步驟：

a)挑取出發酵母菌株單菌落接種于YPD液體培養基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振蕩培養18～24h得菌液；

b)用無菌水將菌液稀釋至0.5～1.0×10⁷CFU/mL得菌體稀釋液，將100～150μL菌體稀釋液均勻涂布于無菌平皿中央，然后用無菌風吹干得菌膜；

c)將菌膜置于離子注入機的無菌靶臺上，并按以下條件對菌膜進行低能離子注入：注入離子為N⁺，注入劑量為1.5×10¹⁵～2.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量為15～25KeV，脈沖時間為5～10s，間隔時間為5～10s，真空度為1.5～2.0×10^-4Pa。

所述高糖固體培養基的組成包括500.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏以及20.0g/L的瓊脂。