[發明專利]一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法

在審

• 申請號: 201410387843.1
• 申請日: 2014-08-07
• 公開（公告）號: CN104164415A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 錢衛東;周穎欣;王婷;寧肖肖;蔡長龍;毛培宏
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12N15/01
• 分類號: C12N15/01;C12R1/645
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 蔡和平

1.一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法，其特征在于：該篩選方法包括以下步驟：

1)初篩：將經過誘變的出發酵母菌株接種于YPD液體培養基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振蕩培養24～28h得預培養液，將預培養液涂布于高糖固體培養基上，然后于28～37℃恒溫培養48～60h，所述高糖固體培養基含有500～550g/L的葡萄糖；

2)復篩：經過恒溫培養后，挑取生長于高糖固體培養基上的單菌落并接種于YPD液體培養基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振蕩培養24～28h得種子培養液，將種子培養液接種于YPD發酵培養基中，然后于160～200r/min、28～37℃下振蕩培養96～144h得發酵液，將發酵液離心，將離心得到的上清液用紙色譜法進行分析，根據紙色譜上D-阿拉伯糖醇對應的顯色斑點篩選D-阿拉伯糖醇產量較高的突變菌株。

2.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法，其特征在于：利用低能離子注入技術對出發酵母菌株進行誘變。

3.根據權利要求2所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法，其特征在于：所述出發酵母菌株為乳酸克魯維酵母。

4.根據權利要求2所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法，其特征在于：所述誘變具體包括以下步驟：

a)挑取出發酵母菌株單菌落接種于YPD液體培養基中，然后于28～37℃、160～200r/min下振蕩培養18～24h得菌液；

b)用無菌水將菌液稀釋至0.5～1.0×10⁷CFU/mL得菌體稀釋液，將100～150μL菌體稀釋液均勻涂布于無菌平皿中央，然后用無菌風吹干得菌膜；

c)將菌膜置于離子注入機的無菌靶臺上，并按以下條件對菌膜進行低能離子注入：注入離子為N⁺，注入劑量為1.5×10¹⁵～2.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量為15～25KeV，脈沖時間為5～10s，間隔時間為5～10s，真空度為1.5～2.0×10^-4Pa。

5.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法，其特征在于：所述高糖固體培養基的組成包括500.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨、10.0g/L的酵母膏以及20.0g/L的瓊脂。

6.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法，其特征在于：所述YPD發酵培養基的組成包括200.0g/L的葡萄糖、20.0g/L的蛋白胨以及10.0g/L的酵母膏。

7.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法，其特征在于：所述紙色譜法采用的展開劑為正丁醇、吡啶與水的混合物，正丁醇:吡啶:水的體積比為14:3:3；紙色譜法采用的顯色劑是飽和硝酸銀-丙酮溶液和飽和氫氧化鈉-無水乙醇溶液，飽和硝酸銀-丙酮溶液的制備方法為：將0.1mL飽和硝酸銀水溶液加入到40mL丙酮中得混合物，向混合物中加入1mL水后通過攪拌使結晶析出的硝酸銀完全溶解，飽和氫氧化鈉-無水乙醇溶液的制備方法為：將10mL飽和氫氧化鈉水溶液與520mL無水乙醇混合；紙色譜法采用的標準品為質量濃度30g/L的葡萄糖水溶液、質量濃度30g/L的D-阿拉伯糖醇水溶液和質量濃度30g/L的甘油水溶液的等體積混合液。

8.根據權利要求1所述一種D-阿拉伯糖醇高產酵母突變菌株的篩選方法，其特征在于：所述篩選方法還包括以下步驟：

驗證：利用高效液相色譜對D-阿拉伯糖醇產量較高的突變菌株的發酵液進行分析。