[發(fā)明專利]一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410387054.8
• 申請(qǐng)日: 2014-08-08
• 公開（公告）號(hào): CN104198449A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李麗;牟蘭;曾晞;沈韻
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 貴州大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64;G01N33/52;C07D311/16;C09K11/06
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標(biāo)事務(wù)有限公司 52002
• 代理人: 徐逸心;袁慶云

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬分析化學(xué)領(lǐng)域，具體地說是一種用于活體細(xì)胞成像的熒光探針方法。

背景技術(shù)：熒光傳感器與熒光顯微技術(shù)的結(jié)合，使熒光傳感器在生物活性物質(zhì)檢測(cè)和細(xì)胞成像方面得到廣泛應(yīng)用。對(duì)生物活性物質(zhì)而言，檢出靈敏度極限是單個(gè)分子。活細(xì)胞成像技術(shù)是生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域種重要的研究手段，與固定細(xì)胞研究結(jié)合起來，可以解釋活細(xì)胞中的多種生命現(xiàn)象。近年來，隨著生命科學(xué)的不斷發(fā)展，人們對(duì)細(xì)胞內(nèi)的活性物種、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及細(xì)胞凋亡等方面的研究越來越深入。美國加州大學(xué)戴維斯分校(UC?Davis)生物光子學(xué)科學(xué)技術(shù)中心(CBST)的科研人員首次通過熒光標(biāo)記成功地對(duì)活腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的納米尺寸區(qū)室的運(yùn)動(dòng)進(jìn)行了成像。這一成果為未來理解癌癥和一大批其他疾病的分子原因和生物力學(xué)的突破進(jìn)展帶來了希望，它還能促進(jìn)神經(jīng)科學(xué)和干細(xì)胞研究等領(lǐng)域。熒光成像分析是目前廣泛應(yīng)用于活細(xì)胞分析的一種高靈敏的可視化分析技術(shù)。目前用于活細(xì)胞成像分析的熒光探針多為有機(jī)熒光染料分子，為活細(xì)胞分析提供了有效的探測(cè)手段。在實(shí)際應(yīng)用中，這些有機(jī)熒光染料分子存在著熒光壽命較短、容易猝滅及穩(wěn)定性差的缺點(diǎn)。所以，實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)連續(xù)測(cè)定，提高可視化分析的選擇性和精度是目前迫切需要解決的問題。而金屬配合物熒光探針具有熒光壽命長(zhǎng)、發(fā)射峰窄、穩(wěn)定性好等發(fā)光性質(zhì)，引起了人們的重視與關(guān)注。有機(jī)染料具有良好的光穩(wěn)定性、合適的水溶性及很好的細(xì)胞膜通透性，而且在細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的熒光，合成相對(duì)簡(jiǎn)單，收率較高。作為細(xì)胞內(nèi)的成像探針，必須滿足（1）良好的水溶性；（2）在生理?xiàng)l件下具有良好的熱穩(wěn)定性和動(dòng)力學(xué)惰性；（3）良好的膜穿透性，并且對(duì)細(xì)胞是無毒的；（4）有較長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)和較高的量子產(chǎn)率。

細(xì)胞內(nèi)的小分子物種包括各種活性氧物種（單線態(tài)氧、過氧化氫、?超氧負(fù)離子自由基等）、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺等是人們研究關(guān)注的焦點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冋{(diào)控著細(xì)胞的諸多功能與性質(zhì)，在細(xì)胞內(nèi)起著非常重要的作用，因此實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞內(nèi)各種生理活性小分子物種的實(shí)時(shí)在線動(dòng)態(tài)檢測(cè)對(duì)生命科學(xué)研究與發(fā)展具有重要的價(jià)值。??

鋅是繼鐵之后人體內(nèi)含量最豐富的過渡金屬離子，是許多生物過程如大腦功能和病理學(xué)、基因轉(zhuǎn)錄、免疫功能和哺乳動(dòng)物繁殖中的重要輔助因子，它的新陳代謝紊亂會(huì)引起諸多疾病。鋅還參與病理過程，如阿爾茨海默氏癥、癲癇、缺血性中風(fēng)和嬰兒腹瀉等。大多數(shù)生物組織中鋅離子或是被緊密地綁定于蛋白、或游離、或螯合等多種形態(tài)存在，細(xì)胞內(nèi)鋅離子的檢測(cè)是人們研究的熱點(diǎn)。熒光傳感器的主要目標(biāo)是對(duì)出現(xiàn)在人體各種組織中，包括大腦、腸道、胰腺和視網(wǎng)膜的鋅離子的檢測(cè)。到目前為止，對(duì)鋅離子的熒光傳感器已經(jīng)成功應(yīng)用在活體細(xì)胞、海馬切片的鋅離子熒光成像。目前利用探針檢測(cè)鋅離子的相關(guān)報(bào)道已有不少，但真正能夠應(yīng)用到活細(xì)胞內(nèi)成像的卻不多。文獻(xiàn)報(bào)道了一種以雙(2-吡啶甲基)胺為Zn²⁺螯合基團(tuán)、二乙基三胺五乙酸為配體的稀土銪探針，并將其用于HeLa細(xì)胞內(nèi)Zn²⁺的成像分析。

發(fā)明內(nèi)容：本發(fā)明的目的在于研究一種能高靈敏、高選擇的對(duì)活體細(xì)胞成像的熒光探針新方法。通過發(fā)明人研制合成的新的熒光探針，是一種對(duì)Zn²⁺高靈敏、高選擇性檢測(cè)識(shí)別的熒光探針，并能實(shí)現(xiàn)對(duì)活體細(xì)胞中微量Zn²⁺的熒光染色和成像。

本發(fā)明一種用于活細(xì)胞成像的熒光探針方法，是以1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，簡(jiǎn)稱探針s3，為細(xì)胞內(nèi)微量Zn²⁺的熒光增強(qiáng)型探針，探針s3及Zn²⁺能分別滲透到活細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞具有良好的相容性，通過探針s3對(duì)細(xì)胞內(nèi)Zn²⁺染色后，用熒光倒置顯微鏡檢測(cè)出清晰的藍(lán)色熒光細(xì)胞圖像，探針s3是一種活細(xì)胞中Zn²⁺的熒光成像試劑。