[發(fā)明專利]一種用于活細胞成像的熒光探針方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410387054.8
• 申請日: 2014-08-08
• 公開（公告）號: CN104198449A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設計）人: 李麗;牟蘭;曾晞;沈韻
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/52;C07D311/16;C09K11/06
• 代理公司: 貴陽東圣專利商標事務有限公司 52002
• 代理人: 徐逸心;袁慶云

1.一種用于活細胞成像的熒光探針方法，其特征是以1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，簡稱探針s3，為細胞內微量Zn²⁺的熒光增強型探針，探針s3及Zn²⁺能分別滲透到活細胞內，與細胞具有良好的相容性，通過探針s3對細胞內Zn²⁺染色后，用熒光倒置顯微鏡檢測出清晰的藍色熒光細胞圖像，探針s3是一種活細胞中Zn²⁺的熒光成像試劑。

2.根據(jù)權利要求1所述的一種用于活細胞成像的熒光探針方法，其特征是用探針s3對細胞內Zn²⁺進行染色，用熒光倒置顯微鏡觀測活體細胞，染色成像的具體方法為：活性PC3細胞經(jīng)復蘇接種于含10%胎牛血清以及含1%雙抗的培養(yǎng)基（RPMI?1640）中，在溫度為37℃，5%?CO₂及飽和濕度為100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天傳代1次，選擇生長狀態(tài)良好的細胞接種于12孔板中培養(yǎng)，密度為2×10⁴個/ml，次日用新鮮培養(yǎng)基清洗細胞兩次，將細胞浸入含10?μmol·L^-1探針s3（900μL培養(yǎng)基+100μmol·L^-1探針s3的DMF/H₂O混合溶液100μL）中，在37℃，5%CO₂、飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中孵育30?min，吸出含探針s3的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)基清洗細胞三次，熒光倒置顯微鏡下觀察并進行亮場和暗場拍照；再浸入含50?μmol·L^-1?Zn²⁺溶液（900μL?培養(yǎng)基+500μmol·L^-1?Zn²⁺溶液100μL），在37℃、5%CO₂、飽和濕度100%的培養(yǎng)箱中孵育30?min，進行細胞內探針對Zn²⁺染色，吸出含Zn²⁺溶液的培養(yǎng)液，染色后的細胞再用新鮮培養(yǎng)基清洗三次，在熒光倒置顯微鏡下觀察探針對細胞內Zn²⁺染色后的熒光成像，對細胞影像拍照獲得清晰的細胞輪廓影像。

3.根據(jù)權利要求1所述的一種用于活細胞成像的熒光探針方法，其特征是細胞成像中，探針s3和Zn²⁺都能滲透到活體PC3細胞內，細胞呈圓滑飽滿狀，探針與細胞具有良好的相容性，未見細胞凋亡，對細胞無毒性；探針與Zn²⁺離子在細胞內染色后，熒光倒置顯微鏡檢測顯示了清晰的藍色熒光細胞分布，染色具有特定區(qū)域的選擇性聚集能力。

4.根據(jù)權利要求2所述的一種用于活細胞成像的熒光探針技術，其特征是所用的試劑為分析純或生化試劑，所用水為二次蒸餾水或生理鹽水；所用活體PC3細胞為人體前列腺癌細胞；所用的拍照設備為熒光倒置顯微鏡。

5.根據(jù)權利要求1所述的一種用于活細胞成像的熒光探針方法，其特征是所述探針s3化學結構式為：

s3

???分子式：C₂₁H₁₄N₄O₇

分子量：434.09

熔??點：大于300?℃溶解性：微溶于氯仿、二甲亞砜、N,N-二甲基甲酰胺等，不溶于乙醇,光譜性質：在N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液與水的混合溶劑（v/v，2/3）中的熒光激發(fā)波長是310nm，發(fā)射波長是454nm，紫外吸收波長是310nm。

6.根據(jù)權利要求1所述的一種用于活細胞成像的熒光探針方法，其特征是作為細胞成像的熒光探針s3，化學名稱為1,5-二(7-羥基-8-香豆素亞甲基)-二氨基脲，是本發(fā)明人合成。