[發明專利]漢城型漢坦病毒的Taqman探針熒光定量快速檢測方法

有效

• 申請號: 201410386807.3
• 申請日: 2014-08-08
• 公開（公告）號: CN104152581A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發明（設計）人: 盛金良;郭剛;王凌波;吳熙然;何冰;高博;楊霞;李卉;王燕;孫德強
• 申請（專利權）人: 盛金良
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于病毒檢測技術領域，涉及漢城型漢坦病毒的Taqman探針熒光定量快速檢測方法。

背景技術

漢坦病毒(hantavirus，HV)屬布尼亞病毒科漢坦病毒屬，是腎綜合征出血(hemorrhagicfeverwithrenalsyndrome，HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(hantaviruspulmonarysyndrome，HPS)的病原體。此病的傳染源是帶病毒的宿主動物，主要為嚙齒類動物，每種基因型的HV有其主要的宿主動物，其中黑線姬鼠和褐家鼠分別攜帶漢坦型HV和漢城型HV，是主要宿主和傳染源。漢坦病毒是腎綜合征出血和漢坦病毒肺綜合征的病原體。隨著分子生物學技術發展，對HV本質和特征研究證實HV至少包括6個血清型：漢坦病毒、漢城病毒、普馬拉病毒、希望山病毒、泰國病毒和索托帕拉亞病毒等。全世界每年漢坦病毒病的發病人數為6萬～10萬，中國是受HV危害較為嚴重的國家。漢坦病毒肺綜合征主要引起急性發熱，進行性呼吸衰竭，病死率高達40％-60％。HV流行廣泛，危害嚴重，已成為一個全球性的公共問題。因此，建立一種快速、特異、靈敏、定量檢測漢坦病毒的方法很有必要，對漢坦病毒感染的預防控制有著非常重要的意義。

HFRS的實驗室診斷一直是比較活躍的研究領域，人們一直希望從組織和標本中直接檢測出病原體.用動物和細胞培養分離病毒是最為可靠的，但由于HV的分離培養對標本要求高，分離周期長(每傳一代標本需觀察20d～30d)，在胞內增殖不出現典型的細胞病變，需要用免疫熒光試驗檢測病毒的毒力和要求較高的生物安全防護等，而常常不適于大規模的流行病學調查。特別是有些試驗感染HV病毒的動物，其免疫熒光的結果往往是陰性的，而將此試驗動物的內臟組織制備成懸液，卻可使其它的健康動物遭受感染。

目前血清學檢測方法仍然是漢坦病毒的主要檢測手段，用IIF檢測IgM和IgG最常用。但是以往的血清學診斷方法，如間接免疫熒光試驗、斑點免疫結合試驗、帶狀免疫斑點試驗等敏感性和特異性不夠高，給臨床診斷帶來一定限制，常造成漏診和誤診，使患者得不到及時有效的治療。因此有必要建立一種高靈敏的、高特異的檢測技術。

熒光定量PCR(fluorescencequantitativePCR，FQPCR)技術是近幾年發展起來的新技術，既保持了PCR技術靈敏、快速的特點，又克服了以往PCR技術中存在的假陽性污染和不能進行準確定量的缺點。實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。其避免了傳統PCR方法以終產物檢測定量產生的偏差，提高了實驗的可復性。因此實驗應用TaqMan探針建立了漢城型漢坦病毒的熒光定量PCR檢測方法。

現有技術一：血清學診斷是漢坦病毒感染的主要診斷方法，用IIF檢測IgM和IgG最常用，酶免疫測定(ElA)檢測IgM，利用核蛋白進行的IgG檢測，適用于疾病的早期診斷和大量血清流行病學調查；免疫印跡敏感而特異，是一種快速的抗體檢測方法，可用于區分不同漢坦病毒引起的感染。檢測技術存在的問題：1，檢測方法復雜，步驟繁瑣，2，檢測結果可能產生假陽性和難以進行定量檢測。3，檢測過程時間長，反應速度慢。

現有技術二：應用RT-PCR方法檢測病毒，PCR法其靈敏性高，特異性好以及快速簡便的優點被廣泛采用。RT-PCR技術存在的問題是：1基因的高效擴增，可能產生假陽性結果和難以進行定量檢測。2電泳過程中的染色劑EB(溴化乙錠)為強烈致癌物質，若操作不當，會嚴重危害操作者的身體健康。3定量方法都是針對PCR終產物來進行的，而PCR的平臺效應在一定程度上干擾了PCR的原始模板數量和終產物之間的相關性，使定量準確度難以提高。

發明內容

本發明的目的在于提供漢城型漢坦病毒的Taqman探針熒光定量快速檢測方法，解決了現有的漢坦病毒感染檢測方法復雜，反應速度慢，檢測精度低的問題。

本發明建立一種漢城型漢坦病毒的Taqman探針熒光定量快速檢測方法，以鼠肺組織中克隆的漢城型漢坦病毒M基因片段為基礎，設計特異的熒光定量PCR引物和探針，以pGM-T重組的M基因為標準品，按10倍從10⁷-10¹稀釋，制作漢城型漢坦病毒的熒光定量標準曲線，建立漢城型漢坦病毒的Taqman探針熒光定量方法，該方法能夠對組織樣本中的漢城型漢坦病毒進行定性和定量分析，該方法檢測精度高(能達到10個拷貝)，所需時間短(1.5小時內完成)。

本發明所采用的技術方案是按照以下步驟進行：