[發(fā)明專利]奶牛致病菌五重PCR反應試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410384616.3
• 申請日: 2014-08-07
• 公開（公告）號: CN104152555A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設計）人: 楊玉英;胡婧;翟軍軍;孫海英
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14;C12Q1/04;C12R1/19;C12R1/42;C12R1/01
• 代理公司: 大慶市建華專利事務所 23119
• 代理人: 孫薇

技術領域

本發(fā)明屬于動物分子生物學領域，涉及一種奶牛致病菌五重PCR反應試劑盒。

背景技術

隨著規(guī)模化奶牛場的不斷發(fā)展，國內外有關機構和研究者逐漸重視牛舍的環(huán)境質量問題。現在奶牛飼養(yǎng)密度大，每頭牛的生活和運動空間都相對擁擠，牛舍環(huán)境質量下降，病原菌繁殖加快，致使牛舍受到污染。致病菌、條件性致病菌和非病原菌都可存在牛舍環(huán)境中，當這些細菌達到一定程度時，就會暴發(fā)系列疾病。牛舍環(huán)境質量的好壞不僅直接影響了牛的正常生長和生產性能，還決定了畜產品的質量和養(yǎng)牛業(yè)的生產效益。所以，環(huán)境中致病菌是影響人和動物健康的潛在因素，環(huán)境衛(wèi)生管理一有疏忽，它們就會趁虛而入，給養(yǎng)殖業(yè)造成經濟損失，嚴重者甚至影響到社會發(fā)展和政治穩(wěn)定。因此檢測和控制環(huán)境中病原菌的問題需亟待解決。

環(huán)境中的病原菌主要有大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、單核增生性李氏桿菌等，它們在一定程度上均可導致動物的感染。致病型大腸桿菌有很多種，其中，腸毒素型大腸桿菌是引起腹瀉最常見的大腸桿菌。在世界范圍內，它可引起犢牛嚴重的水樣腹瀉。這種菌主要在小腸近端居留，通過產生腸毒素而致病。產腸毒素大腸桿菌有不耐熱腸毒素(LT)和耐熱腸毒素(ST)兩種。沙門氏菌的主要致病物質有脂多糖、腸毒素、內毒素、侵襲力。沙門氏菌的侵襲蛋白(invasion?protein,inv)決定細菌粘附和進入宿主上皮細胞的能力，與細菌致病性密切相關，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門氏菌的主要毒力因子，也是毒力島SPI基因之一。染色體上的侵襲基因invA是一段只存在于致病性沙門菌中獨特的保守基因序列。在沙門氏菌屬中invA基因序列有很高的同源性，與其它生物沒有同源性，是目前沙門氏菌檢測的主要靶點。金黃色葡萄球菌可以分泌多種毒力因子，如葡萄球菌溶血素、腸毒素、凝固酶、耐熱核酸酶等，這些毒素和酶致病性強，可引起創(chuàng)傷性感染、膿腫、蜂窩織炎、乳腺炎、關節(jié)炎、敗血癥、毒素休克綜合癥、心內膜炎、中毒性嘔吐、腸炎等癥狀。金黃色葡萄球菌nuc基因編碼的耐熱核酸酶是一種胞外酶，為金黃色葡萄球菌所特有，耐熱核酸酶蛋白的nuc基因編碼已全部定序，只要通過nuc基因的特異性擴增就可以快捷準確地檢測出金黃色葡萄球菌。單核增生性李氏桿菌對人和動物均有侵襲力，可導致食物中毒，是一種人畜共患的食品病原菌。人、畜感染后主要表現為腦膜炎.敗血癥及孕婦流產，有的可出現單細胞增多，溶血素為李斯特菌的主要致病因子，由hly基因編碼，單核細胞增多性李斯特菌hlyA基因具有較高的保守性和特異性。因此，hly基因可作為單核增生性李氏桿菌的靶基因。

傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定等檢測方法無法對難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物進行檢測，而且特異性不高、靈敏度低、操作繁瑣耗時，難以滿足飛速發(fā)展的集約化養(yǎng)殖生產對檢測速度的要求，不能實現有效的監(jiān)測、預防作用。因此，開發(fā)快速檢測環(huán)境中致病菌技術，并對其進行控制成為保障畜舍環(huán)境公共衛(wèi)生和畜產品安全的重要任務之一。

在國外，多年來，許多研究人員已創(chuàng)建了不少快速、特異、敏感、低耗且實用的細菌學檢測方法。尤其是免疫酶聯法、DNA探針、多聚酶聯反應、生物感受器、基因芯片等技術的發(fā)展和應用，明顯提高了人類對環(huán)境致病菌的認識及檢測水平。但國內對致病菌的免疫學和分子生物學檢測方法也有一定的研究，對其應用較少，相比傳統(tǒng)方法所需儀器設備相比要求高，在很大程度上限制了這些方法的應用，大大降低了其實用價值。多重PCR技術簡單、快速，實用性高，因此，可以考慮應用多重PCR技術為奶牛致病菌的快速檢測提供一種新的思路。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種奶牛致病菌五重PCR反應試劑盒，克服關于奶牛致病菌傳統(tǒng)檢測手段特異性不高、靈敏度低、操作繁瑣耗時等問題，還能克服傳統(tǒng)檢測不能實現有效監(jiān)測和預防作用的問題。

本發(fā)明通過以下技術方案來實現：奶牛致病菌五重PCR反應試劑盒，包括10×PCR反應緩沖液，Mg²⁺，dNTP，引物和Taq酶，所述的引物為：

(1)檢測產腸毒素性大腸桿菌LT基因的引物：

F1：5′-CTGACTCTAGACCCCCAGATGAAAT-3′(SEQ?ID?No.1)

R1：5′-CTGTCCTGCTAAGTGAGCACTTCTC-3′(SEQ?ID?No.2)

(2)檢測產腸毒素性大腸桿菌ST基因的引物：

F2：5′-AAAACCAGATAGCCAGACAATTAAC-3′(SEQ?ID?No.3)