[發明專利]一種快速提取和純化福爾馬林固定組織中DNA的方法在審

申請號：	201410383891.3	申請日：	2014-08-06
公開（公告）號：	CN104328108A	公開（公告）日：	2015-02-04
發明（設計）人：	翟仙敦;莫耀南;秦豪杰;張振芳;薛小琦;趙貴森;艾紅偉	申請（專利權）人：	河南科技大學
主分類號：	C12N15/10	分類號：	C12N15/10
代理公司：	鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119	代理人：	牛愛周
地址：	471003 河***	國省代碼：	河南;41
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摘要：
搜索關鍵詞：	一種快速提取純化福爾馬林固定組織 dna 方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及一種快速提取和純化福爾馬林固定組織中DNA的方法，屬于法醫學技術領域。

背景技術

福爾馬林固定組織是病理學、法醫病理學和法醫遺傳學等學科進行疾病診斷和案例分析常用檢材，這些標本均需在福爾馬林中固定數月乃至數年，作為一種重要的個人實物檔案，為解決涉嫌醫療糾紛、保險欺詐、財產繼承等民事或刑事案件提供了一種極為重要的、可靠的法醫物證檢材。但是常規提取方法對福爾馬林固定組織進行基因分型時，難以獲得穩定、可靠的分型結果，這是由于福爾馬林對標本DNA質量和擴增產生影響，導致提取的標本DNA質量下降，進而使PCR擴增產物的生成及后續的生物學分析變得困難。

福爾馬林對DNA分子有4種化學修飾作用：1)核酸甲基化作用，2)由于甲基化作用而形成的交聯，3)誘導形成嘌呤二聚體，4)導致核酸中磷酸二脂鍵斷裂。福爾馬林通過改變標本組織的核酸分子排列導致DNA發生不同程度的降解。影響從福爾馬林保存標本中提取DNA質量的因素包括福爾馬林導致的DNA與蛋白質之間、蛋白質與蛋白質之間、DNA與DNA之間的交聯，福爾馬林溶液的化學成分、pH值及濃度，標本保存的時間和溫度，標本保存部位等。此外，福爾馬林固定標本的DNA降解成不同長度的片段也不利于標本DNA進行PCR擴增反應。比如小片段DNA與大片段DNA共同競爭Taq聚合酶，而小片段DNA無法進行有效擴增，因此PCR反應被抑制。福爾馬林也會導致DNA中N-糖基水解，產生非嘌呤和非嘧啶位點，大量的非嘌呤和非嘧啶位點聚集在引物區導致引物與DNA模板無法正常連接等。

徐來祥等提出了一種從浸泡福爾馬林的大倉鼠肝臟和日本鰻鱺肌肉標本中提取基因組DNA的方法(《福爾馬林保存的動物標本基因組DNA的提取方法》，動物學報，2002，48(2):264～269)。取浸泡于福爾馬林中的大倉鼠肝臟或日本鰻鱺肌肉適量，用PBS溶液沖洗，放在滅菌的吸水紙上將其揩干，于超凈工作臺內用無菌剪刀將材料剪成50mg的小塊，放入PBS溶液沖洗；然后轉入70％的乙醇中處理12～24h。依次換入下列梯度酒精中處理：80％乙醇，2h，重復一次；90％乙醇，2h，重復一次；95％乙醇，2h，重復一次；100％乙醇，1h，重復一次。然后將材料放入1/2倍的PBS液中浸泡12h，期間更換一次溶液。提取方法參考Sambroock等人(1989)，加入蛋白酶K的量按照準量(100μg/mL)，在50～56℃溫浴3～6h處理過程中，不斷輕搖混勻，視消化效果可以重復加入標準量的1/2倍蛋白酶K進行消化，直至將材料完全消化為止；酚氯仿抽提最后依次的上清液移入透析袋中透析；沉淀DNA時，在-20℃下20min效果為宜。該方法的主要特點在于對標本進行預處理，在保證不使DNA進一步降解的前提下，首先去除標本中所含的福爾馬林成分，然后利用改進的酚氯仿抽提法提取該類標本的基因組DNA，再進一步用透析法純化DNA。研究結果表明，采用該方法提取和純化被試標本基因組DNA能較好地應用于RAPD、微衛星位點的PCR擴增、Southern和斑點雜交。然而，尚無法滿足法醫學實驗室需要的基因組DNA。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速提取和純化福爾馬林固定組織中DNA的方法。

為了實現以上目的，本發明所采用的技術方案是：

一種快速提取和純化福爾馬林固定組織中DNA的方法，包括以下步驟：

(1)取福爾馬林固定組織，蒸餾水沖洗后破碎組織，用濾紙吸干；

(2)在步驟(1)的組織中加入無水乙醇浸泡1～5分鐘，離心，棄去上清；再依次加入濃度70～80％的乙醇和濃度40～60％的乙醇，重復以上步驟，最后留取沉淀；

(3)在步驟(2)留取的沉淀中加入細胞裂解液、十二烷基磺酸鈉和蛋白酶K，在溫度55～65℃下孵化處理，離心，取上清液；

(4)在步驟(3)的上清液中加入鹽，混勻，在溫度-4～4℃下靜置分層，離心，取上清液；

(5)在步驟(4)的上清液中加入DNA結合液，混勻，轉移到固定有二氧化硅膜的套管內，離心，棄去液體，洗脫DNA，即得。

所述步驟(2)中浸泡時可輕微震蕩，保證乙醇充分接觸破碎的組織。

所述步驟(2)中離心的轉速為10000～12000rpm，離心時間3～5分鐘。

所述步驟(2)中留取沉淀后自然晾置3～5分鐘，以使乙醇充分發揮。