[發明專利]一種分離培養兔骨髓間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201410380350.5
• 申請日: 2014-08-05
• 公開（公告）號: CN104178453B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 朱恒;李眾利;張毅;張浩;白曉偉;劉元林
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

技術領域

本發明涉及生物技術領域,具體涉及一種分離培養兔骨髓間充質干細胞的方法。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal?stem?cells,MSCs)是一類具有高度分化潛能的干細胞，能夠在體內和體外分化為肌腱組織細胞、成骨細胞、脂肪細胞、肝臟細胞、胰島細胞、肌肉細胞和軟骨細胞等多種組織類型的細胞。除了其高度的分化潛能之外，MSCs自身免疫原性較低，進行同種異體間移植時不會被受者的免疫系統排斥。基于這些特性，MSCs目前被視為再生醫學、發育學和組織工程研究領域最重要的種子細胞之一。

但是，隨著對MSCs研究的深入，越來越多的未知領域展現出來，等待深入研究。為了探索MSCs的治療作用及其相關機制，研究人員往往需要建立相關疾病的動物模型，給予MSCs治療，開展深入研究。因此，如何高效可靠地培養出相關實驗動物的MSCs已經成為相關研究領域的重要任務之一。MSCs最早在骨髓中被分離培養出來，隨后陸續在全身的多種組織中被發現，然而到目前為止，骨髓來源的MSCs仍然被國際干細胞學會視為進行MSCs鑒定的“金標準”，其生物學特性最符合經典的MSCs特性，即：成纖維細胞樣的形態，特定的細胞免疫表面標記和分化為三種以上成熟組織細胞的能力。進一步研究表明，骨髓內有適宜MSCs居住的微環境，也被稱為干細胞龕。在人和動物體內，骨髓呈現出一種膠凍狀的網狀結構，也稱為骨髓栓。當骨髓栓的結構受到外力破壞時，干細胞龕也被破壞，導致MSCs的增殖、分化等生物學特性受到損害。因此，在分離培養MSCs時，要盡量避免損害干細胞微環境。

兔子作為最常用的實驗動物之一，具有繁殖能力強，體型小，飼養成本低，便于實驗操作等優點，目前被廣泛應用于醫學和生物學研究。不過，當人和其它實驗動物的MSCs分離培養方法應用于兔子MSCs分離培養時，卻遇到了難題。原因之一是，傳統的操作方法對于骨髓MSCs機械損傷較大。一直以來，研究人員分離兔骨髓MSCs均是先通過骨髓腔穿刺技術將兔子骨髓抽出，然后采用紅細胞裂解液裂解紅細胞/或者密度梯度離心去除紅細胞，再將骨髓細胞制備為單細胞懸液進行培養，最終從貼壁細胞中純化出MSCs。在此過程中，骨髓被機械力強行抽吸，吹打，原有的干細胞龕被破壞，造成MSCs的收獲量下降，生物學特性改變。兔MSCs難以培養的另外一個重要原因就是兔子骨髓細胞中的造血細胞如巨噬細胞等容易貼附于培養瓶，難以通過傳代培養去除，這就導致分離獲得的MSCs不純，影響了兔子MSCs相關實驗的說服力。

發明內容

本發明的目的是提供一種分離完整兔骨髓栓，用膠原酶消化，并將消化后的骨髓栓進行培養，以此培養兔骨髓MSCs的方法，利用本方法可獲得數量多、純度高的兔骨髓MSCs。

發明人發現：首先，組織塊培養技術可以在一定程度上保存干細胞龕，避免骨髓被制備成單細胞懸液過程中機械力對于MSCs的損傷；其次，膠原酶可以特異地降解骨髓栓(bone?marrow?plug)中的膠原，松解組織結構幫助MSCs從干細胞龕中遷移到培養瓶中；再次，膠原酶消化后，骨髓栓中的造血細胞大量釋放出來，將這些造血細胞全部丟棄，僅僅培養消化后的骨髓栓，可以顯著提高兔子骨髓MSCs的純度。以此為基礎，建立了一種從兔子骨髓中分離培養MSCs的方法，能提供數量多和純度高的兔子骨髓來源的MSCs。

本發明通過以下技術方案實現：

一種分離培養兔骨髓間充質干細胞的方法，包括如下步驟：

(1)從兔骨髓腔內分離出完整骨髓栓，并采用膠原酶在35～38℃、5％CO₂條件下消化0.5～1小時；將骨髓栓置于重量百分濃度為0.1～0.15％、溶劑為含有15％～20％體積胎牛血清的α-MEM培養基的膠原酶溶液中進行消化。

分離骨髓栓的方法為：取2～20周齡健康新西蘭白兔，空氣栓塞處死，用75％酒精浸泡3～5分鐘后，無菌條件下分離兔股骨和脛骨，去凈表面組織，以剪刀和鑷子去除股骨和脛骨的兩端，沿長骨長軸剪開骨髓腔，以鑷子分離出完整的骨髓栓。

(2)將消化后釋放出的造血細胞丟棄，將消化后的骨髓栓種于培養基，在35～38℃、5％CO₂條件下培養24～72小時。

(3)第一次全量換液，去除骨髓栓，保留從骨髓栓中遷移出的MSCs，然后每隔兩天半量換液，在35～38℃、5％CO₂條件下培養3～15天，即可得到大量兔骨髓MSCs。

步驟(2，3)所用培養基為含有1～2mmol/L谷氨酰胺，10～15％體積胎牛血清的α-MEM培養基。