[發(fā)明專利]一種分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410380350.5
• 申請(qǐng)日: 2014-08-05
• 公開（公告）號(hào): CN104178453B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱恒;李眾利;張毅;張浩;白曉偉;劉元林
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號(hào): C12N5/0775
• 分類號(hào): C12N5/0775
• 代理公司: 北京眾合誠成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

1.一種分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包含以下步驟：

(1)從兔骨髓腔內(nèi)分離出完整的骨髓栓，并采用膠原酶消化；

(2)將消化后釋放出的造血細(xì)胞丟棄，將消化后的骨髓栓種于培養(yǎng)基中培養(yǎng)；

(3)首次全量換液，并去除骨髓栓，保留從骨髓栓中遷移出的間充質(zhì)干細(xì)胞，然后每隔兩天半量換液，培養(yǎng)3～15天，即可得到大量兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，分離骨髓栓的方法為：取2～20周齡健康新西蘭白兔，空氣栓塞處死，用75％酒精浸泡3～5分鐘后，無菌條件下分離兔股骨和脛骨，去凈表面組織，以剪刀和鑷子去除股骨和脛骨的兩端，沿長骨長軸剪開骨髓腔，以鑷子分離出完整的骨髓栓。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將骨髓栓置于重量百分濃度為0.1～0.15％、溶劑為含有15％～20％體積胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基的膠原酶溶液中進(jìn)行消化。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化的條件為：在35～38℃、5％CO₂條件下消化0.5～1小時(shí)。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中將骨髓栓在35～38℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24～72小時(shí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中培養(yǎng)條件為：在35～38℃、5％CO₂條件下。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2，3)所用培養(yǎng)基為含有1～2mmol/L谷氨酰胺，10～15％體積胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)間充質(zhì)干細(xì)胞長滿70～80％培養(yǎng)瓶面積后消化傳代，連續(xù)傳代，取第4～6代細(xì)胞進(jìn)一步研究或使用。