[發(fā)明專利]一種水稻種胚RNA的提取方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410379838.6
• 申請日: 2014-08-05
• 公開（公告）號: CN105316316A
• 公開（公告）日: 2016-02-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建福;謝華安;魏毅東
• 申請（專利權(quán)）人: 張建福;謝華安;魏毅東
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域水稻種胚RNA的提取方法。

背景技術(shù)

近年來，隨著生物技術(shù)的進步和發(fā)展，基因的克隆和表達研究，需要從植物材料中提取高純度的RNA。作為植物分子生物學(xué)的基本實驗技術(shù)，盡管RNA的提取技術(shù)已經(jīng)很成熟，但在實際研究中經(jīng)常很難做到順利獲得高質(zhì)量的RNA。其中涉及到很多因素，包括材料保存是否合理，器具處理及操作是否嚴格等，這些因素都容易造成RNA降解。此外，有些植物組織中富含多糖、脂質(zhì)及酚類物質(zhì)，往往不利于RNA的分離和純化。植物的種子中富含脂質(zhì)、儲存蛋白和酚類等次生代謝物質(zhì)，這些物質(zhì)都不利于RNA的提取。目前市面上出售的植物總RNA提取試劑盒眾多，但均存在一定的缺陷，如提取時間長，提取所需條件較苛刻，提取率低，提取的總RNA完整性較差等缺點。

水稻（OryzaSativaL.）是全球重要糧食作物之一，世界上有超過50%的人口以大米為主食。為培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性好、環(huán)境適應(yīng)性強、營養(yǎng)利用率高的優(yōu)質(zhì)水稻新品種，分子生物學(xué)方法得到了廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明提出了一種高效、高質(zhì)量提取水稻種胚RNA的方法，以期為水稻基因組學(xué)研究奠定重要的工作基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種水稻種胚RNA的提取方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案在于：水稻種胚RNA的提取方法，其特征在于：按照一下步驟進行：

(1)將10粒種子剝胚，將胚裝入EP管中，立即加入200ulTripure（Roche），用尖頭玻璃棒快速捅碎，加入800ulTripure，迅速快速顛倒振蕩30s以上，室溫靜置10min；

(2)加入200ul的氯仿，顛倒振蕩使兩相充分混合，室溫靜置10min；

(3)4℃12000g離心10min，吸取上清約450ul加入等量冰異丙醇，輕輕顛倒振蕩充分混合，室溫靜置10min；

(4)4℃12000g離心15min，棄上清并加入1ml75％乙醇，輕輕吹打沉淀，使之飄起，4℃12000g離心3min，棄上清；

(5)重復(fù)步驟(4)，500ul乙醇即可；

(6)將空管12000g離心2min，吸干余液，放置大約30s（時間太長RNA很難復(fù)溶），立即加入30-60ulRNase-freewater，輕輕吹打數(shù)次，使沉淀溶解，隨后水浴65℃5min使其充分溶解并打開二級結(jié)構(gòu)；

(7)如果RNA不立即使用，步驟6加入乙醇后，放置－20℃保存（可存數(shù)月），待用時，取出4℃離心后棄上清進行步驟7；

(8)溶解的RNA最好立即測定OD，跑電泳，操作必需在冰上進行。RNA可保存在－20℃短期保存（三個月之內(nèi)）或-80℃長期保存。如果RNA重新凍融必須吹打混勻后進行后續(xù)實驗。

上述操作步驟需要全程帶口罩，PE手套要經(jīng)常換。

所述步驟(1)前在提取區(qū)域用75%酒精噴灑，實驗臺用酒精棉擦拭。

所述步驟(1)中迅速快速顛倒振蕩30s以上，如果多個樣品，磨一個樣加一個。

所述步驟(3)中吸取的最多不超過550ul，以防DNA污染。

所述步驟(3)樣品太少可放置－80度或－20度，提高RNA產(chǎn)量。

2、本發(fā)明的優(yōu)點在于：提取的水稻種胚RNA中5S，18S和28S條帶清晰，完整性好，利用Nanodrop2000超微量分光光度計測獲得A260/A280比值均在1.95~2.1之間和A260/A230的比值均約2.0，表明提取的RNA質(zhì)量好，可以用于后續(xù)實驗。

附圖說明

圖1實施例的RNA電泳圖。

具體實施方式

下文通過具體實施案例對本發(fā)明做進一步說明。

實施案例1

水稻種胚RNA的提?。?/b>

實驗所需用品包括研缽，藥匙，鑷子，1.5mlEP管，PCR管，槍頭用0.1％DEPC水泡過夜，120℃高壓1h，烘干存放，研缽使用前用酒精燒或180高溫滅菌6h以上。具體操作步驟如下：

(1)取40粒水稻種子，分成四等份，每份10粒。用清水處理0h、3h、6h、12h；

(2)將上述四組種子依次剝胚，分別胚裝入EP管中，加入200ulTripure（Roche），用尖頭玻璃棒快速捅碎，加入800ulTripure，迅速快速顛倒振蕩40s以上，室溫靜置10min；

(3)加入200ul的氯仿，顛倒振蕩使兩相充分混合，室溫靜置10min；