[發明專利]一種高活力酸性蛋白酶

在審

• 申請號: 201410379288.8
• 申請日: 2014-08-04
• 公開（公告）號: CN105316308A
• 公開（公告）日: 2016-02-10
• 發明（設計）人: 李洪兵;李海清;張錦杰;朱永明;胡永明;劉文明
• 申請（專利權）人: 湖南新鴻鷹生物工程有限公司
• 主分類號: C12N9/62
• 分類號: C12N9/62;C12R1/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于酶制劑制備技術領域，具體是一種高活力酸性蛋白酶。

背景技術

酸性蛋白酶是一類最適pH值為2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相對分子質量為30000—40000。酸性蛋白酶主要來源于動物的臟器和微生物分泌物，包括胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶。根據其產生菌的不同，微生物蛋白酶可分為霉菌酸性蛋白酶、酵母菌酸性蛋白酶和擔子菌酸性蛋白酶。根據作用方式可分為兩類：一類是與胃蛋白酶相似，主要產酶微生物是曲霉、青霉和根霉等；另一類是與凝乳酶相似，主要產酶微生物是毛霉等。由于酸性蛋白酶具有較好的耐酸性，因此被廣泛地應用于食品、醫藥、輕工、皮革工藝以及飼料加工工業中。國外關于酸性蛋白酶的研究和生產從20世紀初就開始了。乞今為止，已發現不少微生物可以產生酸性蛋白酶，如黑曲霉(Aspergillusniger)、大孢子黑曲霉突變株(A.nigervar.microsporus)、根霉(Rhizopussp.)、微小毛霉(M.pusillus)、粘紅酵母(Rhdotorulaglutinis)、粟疫霉(Endothiaparasitica)、血紅色陀螺孔菌(Trametessanguinca)、芽枝霉(Cladosporiumsp.)等。1903年，德國科學家從動物的胰臟中提取出胰蛋白酶，并將其用于皮革的柔制。1911年美國科學家從木瓜中提取木瓜蛋白酶，并將木瓜蛋白酶用于除去啤酒中的蛋白渾濁物。自1954年吉田首次發現黑曲霉可產生酸性蛋白酶以來，國內外開始對微生物發酵生產酸性蛋白酶進行了廣泛的研究。1964年國外科學家發現大孢子黑曲霉突變體能產生兩種不同的酸性蛋白酶。1965年又從血紅色陀螺孔菌產酸性蛋白酶，并對該酶進行了純化和結晶。1968年從微小毛霉發酵物中篩選出一種酸性蛋白酶，并對其進行了純化和酶學性質分析。1995年國外科學家對煙曲霉酸性蛋白酶的基因進行了克隆和測序。2001年又從假絲酵母中篩選出一種酸性蛋白酶菌株，并對該酶進行了核苷酸序列分析和功能分析。到目前為止，國外科學家對酸性蛋白酶的結構和功能等已經進行了廣泛系統的研究。

微生物產酸性蛋白酶我國從上世紀60年代就開始研制，1970年上海工業微生物研究所首先從黑曲霉篩選一株3.350產酸性蛋白酶菌株，填補了我國酸性蛋白酶制劑的空白。但3.350酸性蛋白酶菌種發酵活力較低，生產工藝較繁雜。1977年中國科學院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉經誘變、篩選的537高產酸性蛋白酶菌種。近年來國內在酸性蛋白酶方面的研究大多致力于選育產酶活力高、抗逆性好的菌種。目前用于酸性蛋白酶生產的菌種主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和青霉以及它們突變株。錢玉英等(1994年)用60Coγ射線誘變處理黑曲霉CPu菌株，獲得突變菌株6042，產酶活力比出發菌株提高近4倍。章劍林等(1995年)以黑曲霉為出發菌株，采用高溫、超劑量常規誘變方法，獲得了產耐高溫酸性白酶的菌株S3-15，其所產酸性蛋白酶最適pH值為2.5，最適溫度為50℃，90℃下恒溫4h的酶活比出發菌株高64.2％。黃遵錫等(1999年)以黑曲霉YM3019為出發菌株，經紫外線和亞硝基胍誘變處理，獲得高產酶菌株A-1-1，產酶活力約是原始出發菌株的4倍。李永泉等(1999年)，對宇佐美曲霉所產的酸性蛋白酶進行了發酵過程動力學研究。戚淑威等(2006年)對青霉產酸性蛋白酶的適宜條件和酶學性質進行了分析。謝必峰等(2007)采用硫酸銨鹽析法和離子交換層析法分離純化了黑曲霉產酸性蛋白酶，并對其氨基酸組分進行了分析。王云(2008年)通過質譜指紋法對黑曲霉發酵液中所產蛋白進行了分析比對和鑒定酸性蛋白酶分子生物學方面的研究。

國內生產酸性蛋白酶的廠家，基本上都是用537酸性蛋白酶菌種生產。早期生產的微生物酸性蛋白酶，只是工業級的，主要用于皮毛軟化。微生物菌種通過液體通風發酵，成熟發酵醪再經硫酸銨鹽析、板框壓濾、氣流(沸騰)干燥、粉碎、化驗、包裝制成工業級酸性蛋白酶。隨著現代超濾膜濃縮技術在酶制劑行業上的應用，近幾年生產了食品級酸性蛋白酶制劑。食品酸性蛋白酶發酵與工業級相同，只是后提取不同，成熟發酵醪進入絮凝罐，加入絮凝劑絮凝沉淀再經板框壓濾機壓濾，濾清液經超濾膜濃縮器濃縮經化驗合格，加入防腐劑、穩定劑就是成品的濃縮酸性蛋白酶制劑。