[發明專利]一種通過改善細胞通透性生產L(+)-酒石酸的方法

在審

• 申請號: 201410379113.7
• 申請日: 2014-08-04
• 公開（公告）號: CN104140984A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 張建國;潘海峰;謝志鵬;鮑文娜
• 申請（專利權）人: 杭州寶晶生物股份有限公司
• 主分類號: C12P7/46
• 分類號: C12P7/46;C12R1/01
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 陳昱彤

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種生產L(+)-酒石酸的方法。

背景技術

L(+)-酒石酸廣泛存在于自然界中，特別是葡萄和羅望子果中，被稱為“天然酒石酸”，是重要的食品添加劑、醫藥拆分劑、印染防染劑、照相顯影劑、金屬離子屏蔽劑等。微生物轉化法是目前L(+)-酒石酸生產的主要方法，即以含順式環氧琥珀酸水解酶的微生物，轉化底物順式環氧琥珀酸為L(+)-酒石酸。

現有技術已經構建了表達順式環氧琥珀酸水解酶的重組細胞，但是直接用重組細胞生產L(+)-酒石酸主要存在以下2個問題：

（1）重組細胞的順式環氧琥珀酸水解酶雖高效表達，但由于順式環氧琥珀酸水解酶屬于胞內酶，與底物接觸的機會受制于細胞膜的通透性，導致其催化性能低。

（2）重組細胞只能使用一次，利用率低下，成本高，污染大。

表面活性劑，是指具有固定的親水親油基團，在溶液的表面能定向排列，并能使表面張力顯著下降的物質。它是一大類有機化合物，它們的性質極具特色，應用極為靈活、廣泛，有很大的實用價值和理論意義。

固定化微生物細胞是20世紀60年代酶學領域崛起的新技術，利用化學或物理的手段將游離細胞定位于限定的空間區域,以利于細胞內的一種酶或多種酶進行生物催化,并保持細胞活性,可反復使用的一種技術。與傳統游離細胞相比，固定化細胞具有單位體積的菌體密度高、菌體易回收等優點。目前國內外還沒有關于先使用表面活性劑對重組細胞進行通透化處理，進而利用處理后的重組細胞進行L(+)-酒石酸生產的報道，因此利用表面活性劑改善細胞通透性，結合固定化技術提高細胞使用率，對L(+)-酒石酸的生產具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的改善細胞通透性生產L(+)-酒石酸的方法，以克服現有技術的全部或部分缺陷。

為實現上述目的，本發明所采取的技術方案是：本發明通過改善細胞通透性生產L(+)-酒石酸的方法包括如下步驟：（1）發酵培養表達順式環氧琥珀酸水解酶的重組細胞；（2）使用曲拉通系列表面活性劑作為通透劑對所述重組細胞進行通透化處理；（3）利用通透化處理過的重組細胞來生產L(+)-酒石酸。

進一步地，本發明在利用通透化處理過的重組細胞生產L(+)-酒石酸之前，先將該通透化處理過的重組細胞使用κ-卡拉膠固定化。

進一步地，本發明將通透化處理過的重組細胞使用κ-卡拉膠固定化的方法如下：

將通透化處理過的重組細胞懸液加入κ-卡拉膠溶液中混勻，冷卻凝固后用氯化鉀溶液浸泡固定，其中，κ-卡拉膠的終濃度為20-60g/l，通透化處理過的重組細胞的終濃度為10-50g/l。

進一步地，本發明所述κ-卡拉膠的終濃度為30-50g/l，通透化處理過的重組細胞的終濃度為20-30g/l。

進一步地，本發明在所述步驟（2）中，對所述重組細胞進行通透化處理的方法為：將步驟（1）所培養的重組細胞用含有曲拉通系列表面活性劑的生理鹽水懸浮，所述表面活性劑的作用濃度為0.01?-?50?g/L；然后靜置或慢速攪拌懸浮液10?min?-?24?h。

進一步地，本發明所述表面活性劑的作用濃度為0.1?-?10?g/L，靜置或慢速攪拌懸浮液30?min?-?5?h。

進一步地，本發明所述表面活性劑為非離子表面活性劑。

進一步地，本發明所述非離子表面活性劑為以下的任意一種：失水山梨醇脂肪酸酯系列表面活性劑（司盤系列，商品名Span）、聚山梨酯系列表面活性劑（吐溫系列，商品名Tween）、聚乙二醇對異辛基苯基醚系列表面活性劑（曲拉通系列，商品名Triton）、烷基酚聚氧乙烯醚系列表面活性劑（商品名OP）、月桂醇聚氧乙烯醚系列表面活性劑（商品名AEO）。

進一步地，本發明所述非離子表面活性劑優選為聚乙二醇對異辛基苯基醚系列表面活性劑。

進一步地，本發明所述非離子表面活性劑為曲拉通X-100。

相對于現有技術，本發明所取得的有益效果在于：

1．本發明利用經表面活性劑處理的順式環氧琥珀酸水解酶重組細胞生產L(+)-酒石酸，與未經表面活性劑處理的重組細胞相比，順式環氧琥珀酸水解酶重組細胞的轉化時間最高縮短了12倍以上。