[發明專利]抗中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白的單克隆抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201410377739.4
• 申請日: 2014-08-02
• 公開（公告）號: CN104130328A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 程順峰;鄧燈;吳曉春;張敏
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N5/20
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 王鐸;孫洪葉

技術領域

本發明涉及一種由雜交瘤細胞分泌的抗中華絨螯蟹（Eriocheir?sinensis）顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白的單克隆抗體及其制備方法，屬于蟹類細胞免疫學技術領域。?

背景技術

蟹類不具有高等動物完善的特異性免疫系統，缺乏免疫球蛋白，其免疫防御反應主要依賴血細胞及血淋巴中的酶和免疫因子完成。研究表明血細胞可利用吞噬、包埋、傷口修復、滲透調節、胞吐、自溶等方式識別清除外來異物，通過合成釋放凝集素、溶菌素、水解酶、氧化酶等協助完成體液免疫過程，在蟹類抵御外界環境刺激和外來病原物入侵過程中發揮關鍵作用。目前根據細胞化學、形態學及功能方面將蟹類血細胞分為兩大類：顆粒血細胞和透明血細胞。顆粒血細胞胞質顆粒較多，核質比小，而透明血細胞胞質顆粒較少或沒有，核質比大；此外，兩類細胞在功能上有所區別，通常情況下，顆粒血細胞能夠釋放溶菌酶、吞噬素、酚氧化酶、葡糖苷酸酶等，透明血細胞能夠產生活性氧，可以直接參與對外來異物的吞噬。因為尚無合適的分子標記物跟蹤水產蟹類體內兩類血細胞的發生和參加免疫反應的過程，故目前在蟹類兩類血細胞的功能和發生過程等研究方面并無確切定論。單克隆抗體具有靈敏度高、特異性強、性質均一等特點在免疫細胞的研究中早已應用，但在水產蟹類血細胞的研究中應用較少，因此中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜蛋白單克隆抗體的制備為研究顆粒血細胞在中華絨螯蟹非特異性免疫系統中的作用提供了有力工具；利用該單抗可驗證其它蝦蟹類動物血細胞是否具有共同抗原決定簇，此外，研究表明，蟹類受外來病原和環境刺激時,?其血細胞總數會發生顯著變，以中華絨螯蟹顆粒血細胞單克隆抗體為基礎建立的酶聯免疫檢測技術，可以通過監測水產養殖生產中蟹類血細胞數量的變化，進而評估生產實踐中中華絨螯蟹體質及抗逆狀況。?

發明內容

本發明目的之一是提供一種由雜交瘤細胞分泌的抗中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白的單克隆抗體。?

本發明另一個目的是提供上述抗中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白單克隆抗體的制備方法。?

本發明的目的是由以下技術方案實現的：?

一種抗中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白的單克隆抗體，其特征在于所述的單克隆抗體是由名稱為：雜交瘤細胞株ES，保藏號為：CCTCC?NO:?C201414，保藏單位為：中國典型培養物保藏中心，地址：湖北省武漢市武漢大學，保藏日期為：2014年01月07日的雜交瘤細胞分泌的。倒置顯微鏡下觀察該雜交瘤細胞生長狀態良好，表現為：細胞透亮、個體渾圓、外觀飽滿、大小均一、貼壁良好；該雜交瘤細胞具有無限分裂增殖能力；常規條件下培養該雜交瘤細胞，當培養液顏色由桃紅色轉為黃色，培養液中即含有該雜交瘤細胞分泌的抗中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白的單克隆抗體。

該單克隆抗體能與中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜蛋白發生特異性結合，與所述的單克隆抗體發生特異性結合的抗原決定簇位于中華絨螯蟹顆粒血細胞分子量為30.9kDa的蛋白上。?

一種所述抗中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白單克隆抗體的制備方法，其步驟如下：抽取中華絨螯蟹血淋巴，離心得到全血細胞；全血細胞經流式細胞儀分選得到中華絨螯蟹顆粒血細胞；顆粒血細胞經細胞裂解液、超聲波破碎、離心得顆粒血細胞細胞膜蛋白；以中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜蛋白為樣品進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對30.9kDa蛋白條帶進行蛋白提純；以提純的中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白作為抗原，免疫Balb/C小鼠；取免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合；間接酶聯免疫吸附法篩選陽性雜交瘤細胞株；對陽性雜交瘤細胞株進行克隆，最后篩選得到一株能穩定分泌抗中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞株ES；其分泌的抗體為抗中華絨螯蟹顆粒血細胞細胞膜30.9kDa蛋白的單克隆抗體（簡稱：單抗ES），經激光共聚焦法、流式免疫熒光法和轉印免疫印跡法驗證其特性。?

所述的流式細胞儀分選血細胞是將中華絨螯蟹全血細胞經流式細胞儀分選，得到的兩團細胞中居散點圖中間的一團即為顆粒血細胞。?