[發明專利]一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法

在審

• 申請號: 201410375457.0
• 申請日: 2014-08-01
• 公開（公告）號: CN104131048A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 范文超;丁鵬
• 申請（專利權）人: 洛陽華榮生物技術有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/10;C12R1/19
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 時國珍

技術領域

????本發明涉及一種R-3-氨基丁醇，具體的說是一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法。

背景技術

生物催化具有反應條件溫和、效率高、立體和區域選擇性強、環境友好等特點?,?因此生物催化在新藥的研究和開發中得到廣泛的應用。此外?,?利用理性設計和定向進化對生物催化劑進行改造優化，如提高催化劑的穩定性和底物選擇性,?將使其能夠更好地應用于生產工藝。

R-3-氨基丁醇在有機合成和藥物生產中有著廣泛的用途，結構式如下：

目前用化學方法，在銨鹽，鎳的催化下可以合成消旋3-氨基丁醇（Chem.Abstr.,?1947?,?p.?6199），但尚沒有用生物催化合成的報道。

發明內容

本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法，該方法與化學法相比，具有環境友好，光學選擇性高等優點，原料成本低廉，操作簡便，更適用于工業化大量生產。

本發明為解決上述技術問題所采用的技術方案是：

一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其制備方法包括以下步驟：

步驟一、重組D-轉氨酶基因工程菌的制備

選擇來源于Arthrobacter.sp.的D-轉氨酶野生序列，進行人工設計，設計后的基因序列如SEQ?ID?NO：1所示；將該序列通過全基因合成，克隆入pET24a的Nde?I?和Hind?III位點；轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；挑取陽性轉化子并測序鑒定后，得到重組表達載體；將重組表達載體轉入大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，獲得可以誘導表達重組D-轉氨酶的重組D-轉氨酶基因工程菌；

步驟二、重組D-轉氨酶的制備

將重組D-轉氨酶基因工程菌接種到含有卡那霉素抗性的LB液體培養基中，于37℃培養16h，得到種子培養液；將種子培養液接種到含卡那霉素抗性的TB液體培養基中，接種量為含卡那霉素抗性的TB液體培養基體積的1%；然后置于37℃下培養至OD600值為0.4-1.0，加入異丙基-β-D-半乳糖苷（IPTG）或乳糖，置于28-30℃繼續培養16-24h后，離心收集菌體；采用磷酸鹽緩沖液將收集后的菌體洗一次之后重懸，將懸浮液置于冰浴中超聲破碎后再離心，所得上清液即為重組D-轉氨酶，采用Bradford法檢測其中的蛋白含量，備用；

所述超聲破碎的具體方法為：將懸浮液置于冰浴中采用超聲波破碎，參數為工作5s，間歇15s,?循環數30。

步驟三、R-3-氨基丁醇的制備

在反應溶液中依次加入終濃度為10-300mmol/L的底物、質量濃度為2-15%的助溶劑、終濃度為0.1-1mmol/L的輔因子，?終濃度為0.02-1mol/L的氨基供體和質量濃度為0.2-0.4%的重組D-轉氨酶組成反應體系；將該反應體系在25-30℃的條件下反應24-26h;反應結束后，檢測反應液中R-3-氨基丁醇的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反應液中的R-3-氨基丁醇，用旋轉蒸發除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基丁醇；反應體系的反應過程，取樣采用高效液相進行檢測樣品中R-3-氨基丁醇的生成量，以監控其反應過程。

所述底物為3-羰基丁醇；所述的反應溶液為pH為7.0-10.0的50-100mmol/L磷酸鹽緩沖液，Tirs緩沖液或碳酸氫鹽緩沖液；所述的助溶劑為二甲基亞砜或乙腈；所述的輔因子為磷酸吡哆醛；所述的氨基供體為異丙胺或D-丙氨酸。

有益效果是：

本發明提供的R-3-氨基丁醇的生物制備方法，初始原料為3-羰基丁醇，價格便宜。反應結束后，生成的氨、水、氧氣易于除去，對產品的分離純化沒有干擾，水相體系中只剩下R-3-氨基丁醇，易于分離，有助于提高產品純度和收率，降低分離成本。所需的重組D-轉氨酶可通過構建大腸桿菌基因工程菌，然后通過發酵大量制備，相對易得和廉價。所述反應為“一鍋煮”式，底物和所有酶同時加入開始反應，直接得到終產物R-3-氨基丁醇，中間無需分離提純。工藝成本低，轉化率和產物濃度高，并且沒有副產物影響，該工藝方法適合工業應用。

附圖說明

圖1是本發明R-3-氨基丁醇的生物制備方法的反應原理圖。

具體實施方式

一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其制備方法包括以下步驟：

步驟一、重組D-轉氨酶基因工程菌的制備