[發明專利]一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法

在審

• 申請號: 201410375457.0
• 申請日: 2014-08-01
• 公開（公告）號: CN104131048A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 范文超;丁鵬
• 申請（專利權）人: 洛陽華榮生物技術有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/10;C12R1/19
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 時國珍

1.一種R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其特征在于：其制備方法包括以下步驟：

步驟一、重組D-轉氨酶基因工程菌的制備

按照人工設計如SEQ?ID?NO：1所示的序列進行全基因合成，克隆入pET24a的Nde?I?和Hind?III位點；轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；挑取陽性轉化子并測序鑒定后，得到重組表達載體；將重組表達載體轉入大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，獲得可以誘導表達重組D-轉氨酶的重組D-轉氨酶基因工程菌；

步驟二、重組D-轉氨酶的制備

將重組D-轉氨酶基因工程菌接種到含有卡那霉素抗性的LB液體培養基中，于37℃培養16h，得到種子培養液；將種子培養液接種到含卡那霉素抗性的TB液體培養基中，接種量為含卡那霉素抗性的TB液體培養基體積的1%；然后置于37℃下培養至OD600值為0.4-1.0，加入異丙基-β-D-半乳糖苷或乳糖，置于28-30℃繼續培養16-24h后，離心收集菌體；采用磷酸鹽緩沖液將收集后的菌體洗一次之后重懸，將懸浮液置于冰浴中超聲破碎后再離心，所得上清液即為重組D-轉氨酶，檢測其中的蛋白含量，備用；

步驟三、R-3-氨基丁醇的制備

在反應溶液中依次加入終濃度為10-300mmol/L的底物、質量濃度為2-15%的助溶劑、終濃度為0.1-1mmol/L的輔因子、終濃度為0.02-1mol/L的氨基供體和質量濃度為0.2-0.4%的重組D-轉氨酶組成反應體系；將該反應體系在25-30℃的條件下反應24-26h；反應結束后，檢測反應液中R-3-氨基丁醇的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反應液中的R-3-氨基丁醇，用旋轉蒸發除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基丁醇；

所述底物為3-羰基丁醇；所述的反應溶液為pH為7.0-10.0的50-100mmol/L磷酸鹽緩沖液、Tirs緩沖液或碳酸氫鹽緩沖液；所述的助溶劑為二甲基亞砜或乙腈；所述的輔因子為磷酸吡哆醛；所述的氨基供體為異丙胺或D-丙氨酸。

2.如權利要求1所述的R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其特征在于：步驟二中所述超聲破碎的具體方法為：將懸浮液置于冰浴中采用超聲波破碎，參數為工作5s，間歇15s,?循環數30。

3.如權利要求1所述的R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其特征在于：步驟二所述檢測上清液中蛋白含量的方法為Bradford法。

4.如權利要求1所述的R-3-氨基丁醇的生物制備方法，其特征在于：步驟三中反應體系的反應過程，取樣采用高效液相進行檢測樣品中R-3-氨基丁醇的生成量，以監控其反應過程。