[發明專利]一種基于全基因組結合生物信息學特異性篩選華根霉脂肪酶基因的方法

有效

• 申請號: 201410375196.2
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104195151A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 王棟;徐巖;喻曉蔚
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/70;C12N9/20;C40B40/08;C12R1/845
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種基于全基因組結合生物信息學特異性篩選華根霉脂肪酶基因的方法，尤其是一種基于全基因組結合生物信息學特異性篩選華根霉脂肪酶基因并在重組大腸桿菌中重組表達的方法，屬于基因工程領域。

背景技術

脂肪酶又稱三酰基甘油水解酶(EC3.1.1.3)，是一種廣泛應用的水解酶類，能夠在水相中催化水解底物酯鍵，有些脂肪酶也可以在非水相中催化酯化反應和酯交換反應等。微生物脂肪酶已被廣泛應用于很多工業，如油脂工業、制藥工業、食品工業和飼料工業等。目前已有數百種微生物脂肪酶報道，并且許多已經商品化，但是，由于脂肪酶種類的廣泛多樣性，不同脂肪酶的催化特性，如催化活性(酯合成活性、水解活性、甲醇解活性)、底物特異性、位置選擇性、立體選擇性等有著顯著的差異。為滿足不同行業對特定特性脂肪酶的需求，進一步挖掘微生物脂肪酶資源，開發和制備特定活性的脂肪酶仍然具有重要的現實意義。本發明從具有特定基因資源的微生物出發，欲采用結合生物信息學和特異性篩選技術，基于微生物全基因組的脂肪酶基因挖掘，分類、催化特性預測的基礎上，通過分別檢測大腸桿菌外源表達可溶蛋白和包涵體的不同催化特性的篩選技術，獲得具有特定特性的新型華根霉脂肪酶基因，并在重組大腸桿菌中進行活性表達制備。

由于微生物特性和篩選方法的限制，通過傳統微生物篩選方法獲得特定特性脂肪酶，進而開發新型脂肪酶基因資源的效率一般不高。近年來，現代基因組學技術為深度開發微生物基因資源提供了可能，通過對特定微生物的全基因組測序，挖掘其中相關基因的方法已被研究者所采用。華根霉(Rhizopus?chinensis)CCTCC?No：M201021是從我國傳統微生物載體——大曲中分離得到的一株絲狀真菌，用于白酒生產，具有顯著的催化酯化合成和酯水解的能力，表明其含有豐富的脂肪酶，其中一種脂肪酶已被分離并克隆表達。但進一步研究發現，一種外源表達的華根霉脂肪酶并不具有野生華根霉膜結合脂肪酶催化酯合成的能力，表明華根霉中可能存在其他活性表現形式的脂肪酶。目前該菌株全基因組測序已經完成(Genome?Announcements,2013,1(2):e00195-12)，為進一步挖掘華根霉脂肪酶基因資源提供了可能。現代生物信息學技術及相關軟件也為脂肪酶基因資源的挖掘提供了有效的手段。

此外，脂肪酶的催化特性最終還是由活性測定來確定。而脂肪酶的活性測定方法較多，常用的方法有橄欖油指示劑滴定法、對硝基苯脂肪酸酯(p-NP)法、有機相酯合成法、甲醇水解法等。這些方法分別反映了脂肪酶的不同催化性能，而且不同方法測得的活性間并不具有明顯的對應關系。僅通過一種活性測定篩選方法，欲得到不同催化特性的新型脂肪酶通常是比較困難的。因此，針對特定目標，有必要選擇適當的活性測定方法以篩選特定催化特性的脂肪酶。

通常具有活性的酶，包括野生酶及外源表達酶，均為可溶性蛋白；而不溶性蛋白，如大腸桿菌外源表達的包涵體，通常不表現出酶的活性，需復性后才可能表現相應的活性。本發明基于華根霉基因組資源，主要針對脂肪酶催化酯合成和水解反應的不同性能，分別對候選脂肪酶基因大腸桿菌外源表達可溶蛋白和包涵體進行不同活性檢測和篩選，以獲得具有特定特性的新型華根霉脂肪酶基因，進而在重組大腸桿菌中進行活性表達制備。本發明方法將顯著地提高具有特定特性新型脂肪酶基因獲得的效率，對于其他特性脂肪酶的篩選和制備也提供了有價值的技術方案。

發明內容

本發明的目的是針對脂肪酶及其催化特性的多樣性，克服現有脂肪酶篩選方法針對性不強、效率不高的問題，提供一種基于全基因組結合生物信息學特異性篩選華根霉脂肪酶基因的方法，基于華根霉全基因組序列結合生物信息學挖掘潛在的候選脂肪酶基因，將候選基因分別在大腸桿菌中表達，通過分別檢測可溶蛋白和包涵體部分的活性進行篩選，獲得具有特定催化性能的華根霉脂肪酶基因。

本發明的技術方案主要包括以下步驟：

(1)根據華根霉全基因組基因注釋獲得潛在的脂肪酶和酯酶基因，并對脂肪酶和酯酶進行分類，選擇已知的具有特定催化特性的脂肪酶基因，與所得華根霉基因組中潛在的脂肪酶和酯酶基因進行同源性比對，選擇同源性較高的脂肪酶或酯酶基因，預測其催化特性，作為候選基因；

(2)將候選基因建立脂肪酶基因文庫，在大腸桿菌中表達，分別檢測可溶蛋白和包涵體的不同催化特性，篩選獲得具有特定催化特性的華根霉脂肪酶基因。