[發(fā)明專利]一種通過(guò)基因阻斷提高鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410373431.2
• 申請(qǐng)日: 2014-07-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105316383B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭美錦;曹楠;儲(chǔ)炬;莊英萍;杭海峰
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P29/00
• 分類號(hào): C12P29/00;C12N1/21;C12R1/59
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

本發(fā)明涉及一種通過(guò)基因阻斷提高鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法。首次揭示在土霉素生產(chǎn)菌株中，下調(diào)lsigB基因后，能夠顯著地提高土霉素生產(chǎn)菌株的土霉素產(chǎn)量，單位菌體的土霉素合成量可提高20％以上。本發(fā)明為土霉素生產(chǎn)菌株改造提供了一個(gè)新途徑。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種通過(guò)基因阻斷提高鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)

鏈霉菌的生命周期很復(fù)雜，能夠產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物。這些天然產(chǎn)物為新藥的發(fā)現(xiàn)提供了豐富的前體物資源。至1995年為止，由鏈霉菌中得到的具有抗生素活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物約有7000種。鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素在醫(yī)藥和生命科學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。鏈霉菌以其特有的發(fā)育分化特征和強(qiáng)大的次級(jí)代謝能力，在基礎(chǔ)研究與工業(yè)應(yīng)用方面均具有重要地位?？股氐暮铣膳c大量調(diào)控因子相關(guān)，這些調(diào)控因子通過(guò)調(diào)控抗生素合成途徑中的相關(guān)基因的表達(dá)量，調(diào)控了抗生素的產(chǎn)量。這為進(jìn)一步利用這些調(diào)控因子作為靶點(diǎn)進(jìn)行基因改造，獲得抗生素高產(chǎn)突變菌株，從而實(shí)現(xiàn)抗生素產(chǎn)量的提高提供了肯能。

龜裂鏈霉菌(Streptomyce rimosus)是土霉素(oxytetracycline，OTC)的商業(yè)化生產(chǎn)菌株。土霉素屬于四環(huán)素類廣譜抗生素，能夠抑制對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、陰性菌、支原體、衣原體、立克次體等引起的感染，同時(shí)也可用于治療梨形蟲(chóng)病、附紅細(xì)胞體病。其作用機(jī)理是土霉素能夠可逆性地與30S核糖體亞基結(jié)合，從而抑制氨酰tRNA核糖體復(fù)合體的形成，這樣抑制了細(xì)菌的繁殖。因此研究人員不斷應(yīng)用分子技術(shù)對(duì)S.rimosus進(jìn)行研究，利用重組技術(shù)改造菌株性能、提高抗生素產(chǎn)量，或者以此為骨架合成生產(chǎn)非天然新抗生素。然而，為了提高土霉素的產(chǎn)量，本領(lǐng)域還有必要進(jìn)一步研究提高土霉素產(chǎn)量的方法。

鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成基因常位于同一基因簇中，在基因簇中常包含一個(gè)或多個(gè)途徑特異性調(diào)控基因，它們一般調(diào)控一種抗生素或幾種具有某些共同生物合成途徑的抗生素的生物合成?？股厣锖铣苫虼氐恼{(diào)控是受位于基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子(CSR)在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行調(diào)控的，通常有單轉(zhuǎn)錄調(diào)控子調(diào)控和多轉(zhuǎn)錄調(diào)控子調(diào)控。

但是，鑒于鏈霉菌的次級(jí)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，定位到對(duì)于土霉素產(chǎn)量確實(shí)有調(diào)控作用的基因、且調(diào)節(jié)該基因的表達(dá)對(duì)于鏈霉菌自身生長(zhǎng)不造成重大影響的基因仍然是困難的。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)基因阻斷提高鏈霉菌的土霉素產(chǎn)量的方法。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種生產(chǎn)土霉素的方法，所述方法包括：

(1)在土霉素生產(chǎn)菌株中，下調(diào)lsigB基因(類sigB基因，like-sigB)的表達(dá)；

(2)培養(yǎng)步驟(1)制備的菌株，從而生產(chǎn)土霉素。

在一個(gè)優(yōu)選例中，通過(guò)阻斷(較佳地為插入阻斷)或敲除lsigB基因，從而下調(diào)土霉素生產(chǎn)菌株中l(wèi)sigB基因的表達(dá)。

在另一優(yōu)選例中，在土霉素生產(chǎn)菌株中l(wèi)sigB基因位置插入外源基因，從而阻斷l(xiāng)sigB基因(較佳地，在該基因中第181-680位區(qū)間內(nèi)插入外源基因)。

在另一優(yōu)選例中，所述的外源基因包括pKC1139質(zhì)粒中的部分元件，例如ori T、Ori pSG5、Apr。

在另一優(yōu)選例中，所述的阻斷l(xiāng)sigB基因方法包括：提供表達(dá)載體，所述表達(dá)載體中包含lsigB基因的部分序列(較佳地為第181-680位序列)，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化龜裂鏈霉菌，選擇基因組中整合有外源基因序列片段的重組龜裂鏈霉菌。

在另一優(yōu)選例中，所述的土霉素生產(chǎn)菌株是鏈霉菌。

在另一優(yōu)選例中，步驟(2)的培養(yǎng)方法包括：培養(yǎng)鏈霉菌孢子以形成菌絲細(xì)球，之后接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，30±2℃(較佳地30±1℃)，220±50rpm(較佳地220±20rpm)發(fā)酵。