[發明專利]一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒病基因的方法及其應用

有效

• 申請號: 201410373427.6
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104141011A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發明（設計）人: 韓英鵬;趙雪;李海燕;李文濱
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒病基因的方法及其應用，屬于大豆遺傳技術領域。

背景技術

大豆(Glycine?max)原產于中國，是重要的經濟作物。大豆花葉病毒(soybean?mosaic?virus，SMV)病是危害大豆生產的主要病害之一，嚴重影響大豆產量和品質。培育抗病品種是目前控制SMV流行最有效方法。SMV?N1株系是東北大豆產區的優勢病毒株系之一，利用分子標記技術定位與N1株系抗性相關基因和緊密連鎖的分子標記有益于分子輔助選擇抗性大豆品種的育種實踐。

國內外學者已經報道過這方面的研究。國外方面，Yu等(1994)鑒定出抗SMV的單顯性基因Rsv1，定位在大豆分子連鎖群F上，得到1個SSR標記HSP176和2個RFLP標記pA186及pK644a，均與Rsv位點緊密連鎖，其遺傳距離分別為0.5cM、1.5cM和2.1cM。Imsande(1998)將Rsv1定位于大豆分子連鎖群F的抗病基因簇上。Hates等(2000)利用AFLP標記篩選出R11(518bp)、R12(171bp)、R13(261bp)和R14(312bp)4個標記與Rsv1連鎖，遺傳距離都在3.5cM以內。Jeong等(2002)在Columbia中發現與Rsv1相獨立的單顯性抗SMV基因Rsv3，將其定位在連鎖群B2上。Hayes等(2000)將Rsv4定位在連鎖群D1b+W上，獲得連鎖標記Satt542(4.7cM)和Satt558(7.8cM)。國內方面，鄭翠明(2000)用BSA法篩選出1個與抗性基因有關的RAPD標記OPN980/1070與N3抗性基因連鎖，與抗病基因的遺傳距離為2.1cM。劉麗君等(2002)利用黑農39×合豐25的F2群體，篩選出共顯性RAPD標記OPN1400/1300，與黑農39抗病基因的遺傳距離為8.2cM。王永軍等(2004)利用RIL群體鑒定5個SMV株系(Sa、Sc8、Sc9、N1和N3)，發現5個抗病基因定位在連鎖群D1b+W上。理論上，與抗病基因的遺傳距離小于5cM的分子標記才具有分子輔助選擇的應用價值，以往的研究結果所得到的標記-基因遺傳距離較遠，應用范圍較小。因此，縮小抗病位點的遺傳距離，尋找與抗病位點緊密連鎖的分子標記對于提高分子輔助選擇的效力具有十分重要的意義。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒病基因的方法及其應用，所采取的的技術方案如下：

本發明的一個目的在于提供一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒病基因的方法，其特征在于，從待測大豆中分離提取DNA，通過分子標記SSR64和SG1的引物進行PCR擴增，再利用電泳檢測SSR64引物擴增產物中有無標記基因位點條帶和/或利用基因分型分析系統分析SG1的引物擴增產物的基因型，確定待測大豆種質資源是否具有抗花葉病毒病基因。

所述方法的步驟如下：

1)提取待測大豆樣本的DNA；

2)以步驟1)所提取的DNA為模板，通過分子標記SSR64的引物和分子標記SG1的引物進行PCR擴增；

3)利用電泳檢測步驟2)所得SSR64的引物的擴增產物和/或利用基因分型分析系統分析SG1引物擴增產物的基因型，確定待測大豆種質資源是否具有標記基因位點條帶。

所述分子標記SSR64的引物如SEQ?ID?NO.1-NO.2所示；所述分子標記SG1的引物如EQ?ID?NO.3-NO.4所示。

所述PCR擴增，反應程序為94℃預變性6min，94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s，35次循環，72℃終延伸5min。

所述標記基因位點，編號RsmvN1-2，位于大豆的F連鎖群，具體位于抗大豆花葉病毒病基因共分離的分子標記SSR64和SG1之間，并與分子標記SSR64和SG1緊密連鎖。

所述標記基因位點條帶，SRR64引物擴增的產物大小為152bp，SG1引物擴增的產物大小為80bp。

所述基因分型分析系統分析，是將SG1引物PCR擴增產物離心后，掃描樣品的熒光信號，掃描起始溫度為70℃，結束溫度96℃，掃描結束后溫度降至67℃，判斷掃描所得溶解曲線是否發生變異。

所述方法的具體步驟如下：

1)提取待測大豆樣品葉片中的DNA；