[發(fā)明專利]一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒病基因的方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410373427.6
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104141011A
• 公開（公告）日: 2014-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓英鵬;趙雪;李海燕;李文濱
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

1.一種輔助鑒定大豆抗花葉病毒病基因的方法，其特征在于，從待測大豆中分離提取DNA，通過分子標(biāo)記SSR64和SG1的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再利用電泳檢測SSR64引物擴(kuò)增產(chǎn)物中有無標(biāo)記基因位點(diǎn)條帶和/或利用基因分型分析系統(tǒng)分析SG1的引物擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型，確定待測大豆種質(zhì)資源是否具有抗花葉病毒病基因。

2.權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，步驟如下：

1)提取待測大豆樣本的DNA；

2)以步驟1)所提取的DNA為模板，通過分子標(biāo)記SSR64的引物和分子標(biāo)記SG1的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3)利用電泳檢測步驟2)所得SSR64的引物的擴(kuò)增產(chǎn)物和/或利用基因分型分析系統(tǒng)分析SG1引物擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型，確定待測大豆種質(zhì)資源是否具有標(biāo)記基因位點(diǎn)條帶。

3.權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述分子標(biāo)記SSR64的引物如SEQ?ID?NO.1-NO.2所示；所述分子標(biāo)記SG1的引物如EQ?ID?NO.3-NO.4所示。

4.權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性6min，94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s，35次循環(huán)，72℃終延伸5min。

5.權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述標(biāo)記基因位點(diǎn)，編號RsmvN1-2，位于大豆的F連鎖群。

6.權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述標(biāo)記基因位點(diǎn)，具體位于抗大豆花葉病毒病基因共分離的分子標(biāo)記SSR64和SG1之間，并與分子標(biāo)記SSR64和SG1緊密連鎖。

7.權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述標(biāo)記基因位點(diǎn)條帶，SSR64引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為152bp，SG1引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為80bp。

8.權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，所述基因分型分析系統(tǒng)分析，是將SG1引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物離心后，掃描樣品的熒光信號，掃描起始溫度為70℃，結(jié)束溫度96℃，掃描結(jié)束后溫度降至67℃，判斷掃描所得溶解曲線是否發(fā)生變異。

9.權(quán)利要求1或2所述方法，其特征在于，具體步驟如下：

1)提取待測大豆樣品葉片中的DNA；

2)以步驟1)所提取的DNA為模板，再分別通過SEQ?ID?NO.1-NO.2所示分子標(biāo)記SSR64的引物和SEQ?ID?NO.3-NO.4所示分子標(biāo)記SG1的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性6min，94℃變性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s，35次循環(huán)，72℃終延伸5min；

3)利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測步驟2)所得的分子標(biāo)記SSR64引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測是否含有大小為152bp的條帶；

4)利用Lightscanner基因分型分析系統(tǒng)分析步驟2)所得的分子標(biāo)記SG1引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型，將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物于4000rpm下離心5min，再對樣品的熒光信號進(jìn)行掃描，掃描初始溫度為70℃，結(jié)束溫度為96℃，掃描結(jié)束后降溫至67℃，判斷掃描所得熔解曲線是否存在變異。

10.權(quán)利要求1-9所述方法，用于大豆抗花葉病毒病基因的鑒定、篩選和大豆的遺傳育種。