[發明專利]一種R?3?氨基哌啶的生物制備方法

有效

• 申請號: 201410372141.6
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104178536B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發明（設計）人: 范文超;丁鵬
• 申請（專利權）人: 洛陽華榮生物技術有限公司
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C12N15/70
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙)41120
• 代理人: 時國珍

技術領域

本發明涉及R-3-氨基哌啶的制備方法，具體的說是一種R-3-氨基哌啶的生物制備方法。

背景技術

生物催化具有反應條件溫和、效率高、立體和區域選擇性強、環境友好等特點 , 因此生物催化在新藥的研究和開發中得到了廣泛的應用。此外,利用理性設計和定向進化對生物催化劑進行改造優化，如提高催化劑的穩定性和底物選擇性, 將使其能夠更好地應用于生產工藝。轉氨酶作為生物催化劑主要是用于合成手性氨，手性氨基酸以及手性氨醇。

R-3-氨基哌啶在有機合成和藥物生產中有著廣泛的用途，結構式如下：

目前有用化學方法，在HCl，H₂和催化劑鈀的催化下，在甲醇和水存在的情況下合成R-3-氨基哌啶（US2010/105917）。也有用L-轉氨酶催化拆分消旋3-氨基哌啶，通過降解S-3-氨基哌啶獲得R-3-氨基哌啶的酶催化法（Adv. Synth. Catal. 2008, 350, 807-812）,這種方法轉化率不會超過50%。目前尚沒有用D-轉氨酶直接催化3-酮基哌啶合成R-3-氨基哌啶的報道。

發明內容

本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種R-3-氨基哌啶的生物制備方法，該方法與化學法相比，具有環境友好，光學選擇性高等優點，原料成本低廉，操作簡便，更適用于工業化大量生產。

一種R-3-氨基哌啶的生物制備方法，其特征在于：其制備方法包括以下步驟：

步驟一、重組D-轉氨酶基因工程菌的制備

選擇來源于Arthrobacter.sp.的D-轉氨酶野生序列，進行人工設計，設計后的基因序列如SEQ ID NO：1所示；將該序列通過全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位點；轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；挑取陽性轉化子并測序鑒定后，得到重組表達載體；將重組表達載體轉入大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，獲得可以誘導表達重組D-轉氨酶的重組D-轉氨酶基因工程菌；

步驟二、重組D-轉氨酶的制備

將重組D-轉氨酶基因工程菌接種到含有卡那霉素抗性的LB液體培養基中，于37℃培養16h，得到種子培養液；將種子培養液接種到含卡那霉素抗性的TB液體培養基中，接種量為含卡那霉素抗性的TB液體培養基體積的1%；然后置于37℃下培養至OD600值為0.6-0.8，加入終濃度為0.01mmol/L的異丙基-β-D-半乳糖苷或終質量濃度為0.5%的D-乳糖，置于25-28℃繼續培養20-24h后，離心收集菌體；采用磷酸鹽緩沖液將收集后的菌體洗一次之后重懸，將懸浮液置于冰浴中超聲破碎后再離心，所得上清液即為重組D-轉氨酶，檢測其中的蛋白含量，備用；

所述超聲破碎的具體方法為：將懸浮液置于冰浴中采用超聲波破碎，參數為工作5s，間歇15s, 循環數30。

步驟三、R-3-氨基哌啶的制備

在反應溶液中依次加入終濃度為10-300mmol/L的底物、質量濃度為2-15%的助溶劑、終濃度為0.1-1mmol/L的輔因子、終濃度為0.02-1mol/L的氨基供體和質量濃度為0.2-0.4%的重組D-轉氨酶組成反應體系；將該反應體系在25-30℃的條件下反應24-26h；反應結束后，檢測反應液中R-3-氨基哌啶的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反應液中的R-3-氨基哌啶，用旋轉蒸發除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基哌啶；反應體系的反應過程，取樣并采用高效液相或毛細管電泳進行檢測樣品中R-3-氨基哌啶光學純度（ee值）和轉化率，以監控其反應過程。

所述底物為3-酮基哌啶；所述的反應溶液為pH值為8.0-11.0的50-100mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH值為8.0-11.0的50-100mmol/L Tirs緩沖液或pH值為8.0-11.0的50-100mmol/L碳酸氫鹽緩沖液；所述的助溶劑為二甲基亞砜或乙腈；所述的輔因子為磷酸吡哆醛；所述的氨基供體為異丙胺或D-丙氨酸。

有益效果是：