[發(fā)明專利]一種R?3?氨基哌啶的生物制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410372141.6
• 申請(qǐng)日: 2014-07-31
• 公開（公告）號(hào): CN104178536B
• 公開（公告）日: 2017-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范文超;丁鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 洛陽(yáng)華榮生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12P17/12
• 分類號(hào): C12P17/12;C12N15/70
• 代理公司: 洛陽(yáng)公信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所(普通合伙)41120
• 代理人: 時(shí)國(guó)珍

1.一種R-3-氨基哌啶的生物制備方法，其特征在于：其制備方法包括以下步驟：

步驟一、重組D-轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌的制備

按照人工設(shè)計(jì)如SEQ ID NO：1所示的序列進(jìn)行全基因合成，克隆入pET24a的Nde I 和Hind III位點(diǎn)；轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并測(cè)序鑒定后，得到重組表達(dá)載體；將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）菌株中，獲得可以誘導(dǎo)表達(dá)重組D-轉(zhuǎn)氨酶的重組D-轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌；

步驟二、重組D-轉(zhuǎn)氨酶的制備

將重組D-轉(zhuǎn)氨酶基因工程菌接種到含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)16h，得到種子培養(yǎng)液；將種子培養(yǎng)液接種到含卡那霉素抗性的TB液體培養(yǎng)基中，接種量為含卡那霉素抗性的TB液體培養(yǎng)基體積的1%；然后置于37℃下培養(yǎng)至OD600值為0.6-0.8，加入終濃度為0.01mmol/L的異丙基-β-D-半乳糖苷或終質(zhì)量濃度為0.5%的D-乳糖，置于25-28℃繼續(xù)培養(yǎng)20-24h后，離心收集菌體；采用磷酸鹽緩沖液將收集后的菌體，洗一次之后重懸，將懸浮液置于冰浴中超聲破碎后再離心，所得上清液即為重組D-轉(zhuǎn)氨酶，檢測(cè)其中的蛋白含量，備用；

步驟三、R-3-氨基哌啶的制備

在反應(yīng)溶液中依次加入終濃度為10-300mmol/L的底物、終質(zhì)量百分比濃度為2-15%的助溶劑、終濃度為0.1-1mmol/L的輔因子、終濃度為0.02-1mol/L的氨基供體和終質(zhì)量百分比濃度為0.2-0.4%的重組D-轉(zhuǎn)氨酶組成反應(yīng)體系；將該反應(yīng)體系在25-30℃的條件下反應(yīng)24-26h；反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)反應(yīng)液中R-3-氨基哌啶的含量；然后用乙酸乙酯或二氯甲烷提取反應(yīng)液中的R-3-氨基哌啶，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯或二氯甲烷，即得到R-3-氨基哌啶；

所述底物為3-酮基哌啶；所述的反應(yīng)溶液為pH值為8.0-11.0的50-100mmol/L磷酸鹽緩沖液、pH值為8.0-11.0的50-100mmol/L Tirs緩沖液或pH值為8.0-11.0的50-100mmol/L碳酸氫鹽緩沖液；所述的助溶劑為乙腈；所述的輔因子為磷酸吡哆醛；所述的氨基供體為D-丙氨酸。

2.如權(quán)利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制備方法，其特征在于：步驟二中所述超聲破碎的具體方法為：將懸浮液置于冰浴中采用超聲波破碎，參數(shù)為工作5s，間歇15s, 循環(huán)數(shù)30。

3.如權(quán)利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制備方法，其特征在于：步驟二所述檢測(cè)上清液中蛋白含量的方法為Bradford法。

4.如權(quán)利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制備方法，其特征在于：步驟三中反應(yīng)體系的反應(yīng)過(guò)程，取樣并采用高效液相進(jìn)行檢測(cè)樣品中R-3-氨基哌啶光學(xué)純度和轉(zhuǎn)化率，以監(jiān)控其反應(yīng)過(guò)程。

5.如權(quán)利要求1所述的R-3-氨基哌啶的生物制備方法，其特征在于：步驟三中反應(yīng)體系的反應(yīng)過(guò)程，取樣并采用毛細(xì)管電泳測(cè)定樣品中R-3-氨基哌啶的光學(xué)純度和轉(zhuǎn)化率，以監(jiān)控其反應(yīng)過(guò)程。