[發明專利]一種棉花保衛細胞原生質體的分離方法

有效

• 申請號: 201410371954.3
• 申請日: 2014-07-31
• 公開（公告）號: CN104152396B
• 公開（公告）日: 2017-01-11
• 發明（設計）人: 張驍;趙翔;孔培濤;王雪嬌;高歌
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙)41104
• 代理人: 時立新

技術領域

本發明具體涉及一種棉花保衛細胞原生質體的分離方法。?

背景技術

棉花，錦葵科棉屬植物，植株灌木狀。棉花是世界上最主要的農作物之一，而我國也是棉花產量最高的國家之一。棉花的主副產品都有較高的利用價值，它既是最重要的纖維作物，又是重要的油料作物，也是含高蛋白的糧食作物，還是紡織、精細化工原料和重要的戰略物資。

棉花作為重要的經濟作物和纖維作物，將現代生物技術應用于棉花育種和生產有著廣闊的前景。近年來棉花生物技術發展很快，先后在雜種植株的培育、抗性突變體篩選、轉基因抗病蟲害植株的培育方面都取得了很大的進展。

保衛細胞原生質體是研究氣孔運動、膜通透性和離子轉運過程的重要材料。保衛細胞可說是植物體中最奇妙的細胞，能感受內、外環境信號而調節其本身體積，從而控制氣孔大小，主宰植物體與外界環境所進行的水分、氣體等交換，從而更好地適應不利的環境。然而如何獲得純化有活性的棉花保衛細胞原生質體，利用電生理膜片技術解析棉花保衛細胞質膜離子的跨膜流動，特別是監控K⁺和Ca^2+?跨膜流動情況是解釋棉花響應逆境條件氣孔運動機理的重要前提。遺憾的是，目前沒有對棉花保衛細胞的原生質體分離純化描述，最近有對棉花葉肉細胞原生質體分離的報道（李妮娜，作物學報2014，40(2):?231?239）。葉肉細胞原生質體的獲得，主要用于轉化基因表達檢測。目前，如何分離和純化棉花保衛細胞原生質體，已成為限制棉花氣孔運動調控機制研究的主要因素。?

發明內容

本發明目的在于提供一種棉花保衛細胞原生質體的分離方法，可以制備較為純凈的棉花保衛細胞的原生質體。

本發明所采取的技術方案如下。

一種棉花保衛細胞原生質體的分離方法，包括以下步驟：

（1）取棉花種子，誘導萌發；

（2）取步驟（1）中萌發3~4周后的棉花真葉，漂洗干凈，優選采用無菌水漂洗，撕取表皮條，將收集的表皮條轉入酶解液中，于23~28℃水浴震蕩1.5~2h游離保衛細胞原生質體；

（3）向步驟（2）中酶解結束后混合液中加入混合液5~10倍體積的基本介質，濾網雙層過濾，濾液低速離心，棄上清液，保留離心管管體下端1/3的溶液，所述低速離心為200~300轉/min，離心5~8分鐘；

（4）將步驟（3）中保留溶液加入基本介質重新懸浮，高速離心，棄上清，所述高速離心為700~800轉/min，離心8~10min，重復此步驟2~3次，可獲得純凈的原生質體；

步驟（3）、步驟（4）中所述基本介質為液體，其組分為：谷氨酸鉀10?mmol/?L、MgCl_2?2?mmol/?L、Mes（2-(N-嗎啉)乙磺酸一水合物）?10?mmol/?L，用山梨醇調調滲透壓至550~600?mOsmol?/Kg，1?mmol/?L?KOH調節pH至5.0~6.0。

步驟（2）中所述酶解液體系為：纖維素酶RS?質量分數1.3%，果膠酶Y-23?質量分數0.03%，牛血清蛋白(BSA)?質量分數0.25%，抗壞血酸?0.5?mmol/L，山梨醇調滲透壓至530~550?mOsmol?/Kg，1?mmol/?L?KOH調節pH至5.0~6.0。

步驟（1）中為打破棉花種子休眠，可先將成熟飽滿的棉花種子于80℃水浴浸種2分鐘；然后在16?h光照/8?h黑暗、光強為22?KLux、溫度20~29℃、相對濕度60%至70%的條件下誘導萌發。

步驟（3）中濾網為400目。

本發明所提供的棉花保衛細胞原生質體的分離方法，對棉花葉片的保衛細胞采用一步酶解法，與兩步酶解法相比大大縮短了實驗時間，簡化了實驗操作流程，提高了實驗效率，而且保持了原生質體較高的生理活力，更解決了棉花保衛細胞原生質體分離的難題。棉花保衛細胞原生質體的成功分離，為研究保衛細胞膜通透性、離子轉運以及氣孔運動機理提供了較好的實驗基礎。

附圖說明

圖1為酶解前后棉花保衛細胞的20倍顯微圖像；

圖2為直接高速離心條件下分離棉花保衛細胞原生質體的20倍顯微圖像；

圖3為先低速、后高速離心條件下分離棉花保衛細胞原生質體的20倍顯微圖像；

圖4為膜片鉗實驗檢驗所分離的棉花保衛細胞原生質體活性的檢測結果。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步的解釋說明。

實施例

棉花保衛細胞原生質體的分離方法，包括以下步驟：